精氨酸甲基轉移酶5 發揮促血管平滑肌表型轉化作用研究

劉思彤，段巖，蔡思棟，麥艷琪，羅文威，劉培慶，李卓明

（1.中山大學藥學院，廣東 廣州 510006；2.南方醫科大學珠江醫院特需醫療服務中心，廣東 廣州 510280）

血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）是構成血管壁組織結構的主要細胞類型，它的主要功能是調節血管張力和血流量，從而控制血壓和組織血流分布。成熟的VSMCs 是一種未終末分化且保留可塑性的細胞，可在不同的表型之間進行轉換，分為收縮表型和合成表型。正常成人動脈的VSMCs 以收縮表型為主，而當感知到環境壓力和細胞外信號的刺激，一部分VSMCs 會失去收縮特性并轉化為合成表型，其特征是α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和平滑肌蛋白22（SM22）等平滑肌標記基因的表達減少，細胞呈現高度增殖和遷移，細胞外基質合成增加，使血管產生結構性變化，如管壁增厚、管壁/管腔比值增大、微小動脈數量減少，導致血管重塑（vascular remodeling）[1]。VSMCs 表型轉化在多種心血管疾病的發病機制中發揮關鍵作用，包括動脈粥樣硬化[2]、損傷后再狹窄[3]、血管鈣化[4]、動脈瘤[5]等。因此，探尋VSMCs表型轉化的潛在干預靶標和治療藥物有著亟為重要的臨床意義。

表觀遺傳調控是指不改變基因的DNA 序列而主要通過DNA 或染色質蛋白的化學修飾來調控基因轉錄的機制，廣泛調控細胞分化、個體發育、腫瘤發生和發展等眾多生物學過程。組蛋白甲基化修飾是基于組蛋白翻譯后修飾的重要表觀遺傳調控方式，主要發生在組蛋白N 端的賴氨酸和精氨酸殘基上。組蛋白甲基化在心血管疾病中的調控作用受到廣泛重視，已有報道其對擴張型心肌病、心力衰竭、心肌肥厚和動脈粥樣硬化的病理進展起重要作用[6]。

目前對賴氨酸甲基化的研究較為廣泛和深入，精氨酸甲基化也受到越來越多的關注。催化精氨酸甲基化的酶稱為精氨酸甲基轉移酶（protein arginine methyltransferase，PRMT），目前已發現人源的PRMTs 共有9 個亞型，分別是PRMT1～9[7]。其中，PRMT5可催化精氨酸殘基的單甲基化和對稱二甲基化，從而調節轉錄、RNA 剪接、翻譯和DNA 損傷反應等多種生物學過程[8]。已有大量的研究明確PRMT5 具有促癌作用，可促進多種類型癌癥的發生發展，被認為是腫瘤的潛在靶標[9]。然而，PRMT5在心血管疾病中的研究卻十分有限。

本文通過考察PRMT5在VSMCs表型轉化模型中的表達，利用其抑制劑EPZ015666 和腺病毒過表達手段，探究PRMT5 對表型轉化的影響，為其作為血管重塑相關的心血管疾病的潛在靶點提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、藥物及儀器

特級胎牛血清（ABW）；高糖DMEM 培養基（Gibco）；人血小板衍生生長因子PDGF-BB（Pepro‐Tech）；增殖細胞核抗原（PCNA）、SM22、α-SMA 抗體（Proteintech）；PRMT5抗體（SAB）；BCA蛋白定量試劑盒（Thermo Fisher Scientific）；蛋白Marker（Thermo Fisher Scientific）；ECL 化學發光液（Tanon）；鼠尾膠原蛋白I 型（Solarbio）；PRMT5 過表達腺病毒及空載對照病毒（維真生物）。

EPZ015666是高效、高選擇性的PRMT5小分子抑制劑，被廣泛用作研究PRMT5和精氨酸甲基化的工具藥[10]。本實驗所用EPZ 購自MedChemExpress公司。EPZ粉末用二甲基亞砜（DMSO）溶解配制成1 mmol/L的儲備液，使用時用培養基稀釋。

XD5-1B 型倒置顯微鏡（Olympus）；Forma 371型CO2培養箱（Thermo Fisher Scientific）；SW-CJ-2F型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；5424R型冷凍臺式高速離心機（Eppendorf）；PL602-S型電子分析天平（Mettler-Toledo）；Synergy H1 型酶標儀（BioTek）；PowerPac Basic 型蛋白電泳儀（Bio-Rad）；5200型化學發光成像儀（Tanon）。

1.2 實驗動物

SPF 級180～220 g 雄性SD 大鼠由中山大學實驗動物中心提供，生產許可證號SCXK（粵）2021-0029。實驗根據《中山大學實驗動物生物安全管理實施細則》進行。本實驗經中山大學實驗動物倫理委員會批準，批準編號：SYSU-IACUC-2022-001506。

1.3 VSMCs的原代培養與鑒定

參考文獻[11]方法并進行適當優化，采用組織貼塊法取大鼠主動脈組織塊培養VSMCs。SD 大鼠頸椎脫臼處死，于無菌超凈臺解剖取胸主動脈，去除外部脂肪組織，刮去內膜，剪成小組織塊貼于25 cm2培養瓶，加入5 mL 高糖DMEM 培養基（添加20%FBS 和1%青鏈霉素混合液），將培養瓶底部朝上置于培養箱中，4～6 h 后小心翻轉培養瓶使培養基浸沒組織塊。約5～7 d后可見平滑肌細胞從組織塊爬出，約10～14 d細胞融合度可達80%以上，繼續傳代培養，第3 代起用添加10%FBS 的DMEM 培養基培養，取3～5 代細胞用于后續試驗。采用形態學鑒定和免疫熒光染平滑肌標志性蛋白α-SMA 的方法鑒定培養細胞的純度。

1.4 細胞分組與給藥

本研究共分為5 組：（1）對照組：細胞用無血清DMEM 培養基饑餓處理24 h 后換為2%FBS 的DMEM 培養基正常培養；（2）PDGF-BB 模型組：細胞用無血清DMEM 培養基饑餓處理24 h 后換為2%FBS 的DMEM，加入PDGF-BB（30 ng/mL），根據實驗需求處理12 h，24 h 或48 h；（3）PDGF-BB+EPZ015666 處理組：細胞饑餓處理24 h 后換為2%FBS 的DMEM，同時給予PDGF-BB（30 ng/mL）和EPZ015666（1 μmol/L），根據實驗需求處理12 h，24 h 或48 h；（4）對照GFP 腺病毒組：加入含綠色熒光GFP 的空載腺病毒處理48 h；（5）PRMT5 腺病毒過表達組：加入PRMT5腺病毒處理48 h。

1.5 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測蛋白表達

采用RIPA裂解液（加入1%PMSF）收集細胞總蛋白，離心取蛋白上清，BCA定量試劑盒測定蛋白濃度。取10～20 g蛋白，向其中加入適量5×Loading Buffer并用超純水稀釋為1×，100 ℃金屬浴煮樣5 min。采用恒壓法進行SDS-PAGE凝膠電泳使不同分子量的蛋白分離，采用恒流濕轉法將蛋白轉移到PVDF膜上，5%牛奶封閉1 h。TBST充分洗凈牛奶后將膜裁剪為目標蛋白分子量條帶孵相應的一抗，4°C 搖床孵育過夜。條帶洗凈一抗后室溫孵育對應二抗2 h，洗滌后采用ECL化學發光液處理并顯影。所得的顯影結果用Image J進行灰度統計并定量分析。

1.6 免疫熒光染色檢測α-SMA表達

將VSMCs 接種于共聚焦專用玻底皿中，置培養箱過夜貼壁。棄皿中培養基，PBS 洗3 次，加水浴至37°C 的4%（φ）多聚甲醛固定30 min。PBS 洗3 次，加入1%Triton-PBS 溶液室溫透膜10 min。PBS 洗3 次，加入山羊血清封閉30 min。傾去不洗，加入一抗稀釋液（α-SMA，體積比1∶400），4°C 孵育過夜。PBS 洗3 次，室溫孵育鼠熒光二抗1 h。PBS洗3次，DAPI染核10 min。PBS洗3次，于激光共聚焦顯微鏡下檢測熒光。

1.7 膠原凝膠收縮實驗檢測細胞收縮

參考文獻[12]方法并進行適當優化制備細胞膠原凝膠。胰酶消化細胞，離心，用無FBS 的DMEM重懸，對單個孔，配制345 μL 細胞懸液，使總細胞數為5×104個。冰上操作，加入100 μL 鼠尾膠原混勻。迅速轉移入有6 μL 0.1mol/L NaOH 的EP管中，吹打3～5次。迅速轉移入48孔板中，室溫靜置30～60 min至倒置無液體流動。用刮刀小心貼孔壁分離凝膠，把膠倒入裝有1 mL 5%FBS 無酚紅DMEM 的24 孔板中。24 h后拍照記錄凝膠大小，并用Image J進行凝膠面積統計，計算24 h 時間點的凝膠面積與原始凝膠面積的比值表征細胞收縮能力。

1.8 劃痕實驗檢測細胞遷移

將VSMCs 接種于6 孔板中，待長至融合度為80%左右時，將直尺架于6孔板正上方，用200 μL的槍頭沿直尺劃線，PBS 洗1 次除去懸浮細胞，重新加入PBS，于顯微鏡下找到劃痕視野，拍攝0 h 時間點照片。將PBS 更換為普通培養基或對應藥物處理的培養基，12 h 后棄培養基，PBS 洗1 次后重新加入PBS，于顯微鏡下拍攝照片。用Image J 進行劃痕面積統計，用傷口愈合率（12 h 劃痕面積/原始劃痕面積）表征細胞遷移能力。

1.9 統計學處理

實驗結果數據以表示，用GraphPad Prism 9.0軟件進行統計學分析并作圖，兩組之間比較采用t檢驗，多組間比較用one-way ANOVA，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠主動脈VSMCs形態學及免疫熒光鑒定

采用組織貼塊法培養大鼠原代平滑肌細胞，組織塊貼壁后約5～7 d 可見有細胞從組織塊邊緣爬出，呈長梭形，或呈三角型，不規則型。此后1～2 周增長迅速，形態逐漸拉長，且呈現VSMCs 的特征性“峰-谷”狀生長，“峰”處細胞互相重疊，可疊加多層，“谷”處細胞僅1～2 層，甚至無細胞，這是VSMC 的特征性生長表現（圖1A）。采用免疫熒光染平滑肌細胞特異性蛋白α-SMA 結果呈陽性（圖1B），表明原代平滑肌細胞分離培養成功，后續采用第3～5 代細胞進行實驗。

圖1 大鼠主動脈VSMCs原代培養形態學及細胞免疫熒光鑒定Figure 1 Morphological and cell immunofluorescence identification of primary cultivated rat aortic VSMCs

2.2 PRMT5 在PDGF-BB 誘導的VSMCs 表型轉化模型中的表達

以PDGF-BB（30 ng/mL）持續刺激VSMCs 48 h，可觀察到增殖表型指標PCNA 明顯上調，收縮表型指標SM22 和α-SMA 下調，表明VSMCs 發生表型轉化（圖2）。PRMT5 蛋白在PDGF-BB 誘導的VSMCs 表型轉化模型中表達水平顯著升高（P＜0.05）（圖2）。

圖2 PRMT5 在PDGF-BB 誘導的VSMCs 表型轉化模型中表達增加Figure 2 Increased expression of PRMT5 in PDGF-BB induced VSMCs phenotype transformation model(n=3)

2.3 PRMT5抑制劑EPZ015666對PDGF-BB 誘導的VSMCs表型轉化的影響

在PDGF-BB誘導的VSMCs表型轉化模型上給予1 μmol/L的EPZ處理48 h，與PDGF-BB模型組相比，α-SMA 和SM22 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），說明EPZ 可逆轉PDGF-BB 誘導的收縮表型蛋白下調（圖3A）。使用VSMCs與鼠尾膠原混合制膠，膠的收縮狀態可反映細胞的收縮力。制膠后24 h觀察凝膠面積大小，并計算此時收縮力（凝膠面積/原始面積），比值越小，說明收縮力越強。與對照組相比，PDGF-BB組的24 h凝膠面積與原始凝膠面積的比值顯著增大（P＜0.05），表明其收縮力有所下降；與PDGF-BB 組相比，PDGF-BB+EPZ 處理組的24 h 凝膠面積與原始凝膠面積的比值顯著下調（P＜0.01），表明其收縮力有所上升，即EPZ 處理可逆轉PDGF-BB 誘導的VSMCs 收縮力下調（圖3B）。劃痕實驗可表征細胞的遷移水平。與對照組相比，PDGF-BB 組傷口愈合率（12 h 劃痕面積/原始劃痕面積）增大（P＜0.01），表明VSMCs 的遷移能力增強；與PDGF-BB 組相比，使用EPZ 處理后傷口愈合率減小（P＜0.05），細胞遷移能力下降，表明EPZ 處理可逆轉PDGF-BB 誘導的VSMCs 遷移能力上升（圖3C）。以上結果表明，抑制PRMT5 可阻抑PDGF-BB 誘導的VSMCs表型轉化，維持VSMCs收縮表型，抑制細胞遷移。

圖3 PRMT5抑制劑EPZ015666逆轉PDGF-BB誘導的VSMCs表型轉化Figure 3 PRMT5 inhibitor EPZ015666 reverses PDGF-BB induced phenotypic transformation of VSMCs（n=3）

2.4 過表達PRMT5對VSMCs表型轉化的影響

利用腺病毒過表達PRMT5，與空載組相比，過表達組的PRMT5 蛋白水平顯著升高，說明過表達成功（圖4）。PRMT5 過表達可顯著升高增殖表型標志蛋白PCNA（P＜0.01），并降低收縮表型標志蛋白SM22的表達（P＜0.01），表明過表達PRMT5可促進VSMCs從收縮表型向增殖表型轉化（圖4）。

圖4 過表達PRMT5促進VSMCs表型轉化Figure 4 Overexpression of PRMT5 promotes phenotypic transformation of VSMCs(n=3)

3 討論

作為調控血壓和維持血管結構完整性的主要細胞類型，VSMCs 發揮著重要的病理生理調節作用。VSMCs 異常的表型改變和功能改變是血管重塑的病理基礎，參與多種心血管疾病的病理進程[13]。基于表觀遺傳調控機制探討VSMCs 表型轉化和血管重塑的干預策略和防治靶標，是當前心血管研究領域的熱點。本文聚焦于組蛋白甲基化酶PRMT5，探討PRMT5在VSMCs表型轉化中的作用。本研究發現，PRMT5在PDGF-BB 誘導的VSMCs表型轉化模型中表達顯著增加，提示PRMT5 可能參與VSMCs 表型轉化過程的生物學調控。本研究通過“功能缺失”和“功能獲得”實驗，利用PRMT5 抑制劑EPZ015666 和腺病毒過表達手段，考察PRMT5對VSMCs 收縮表型和增殖表型相關指標的影響。結果表明，EPZ015666 可逆轉PDGF-BB 誘導的VSMCs收縮表型標志蛋白α-SMA 和SM22的下調，逆轉細胞收縮力的下降和遷移能力的增加，表明抑制PRMT5具有抑制VSMCs表型轉化的作用；反之，利用腺病毒過表達PRMT5 可促進收縮指標的下調和增殖指標的上調，證明了PRMT5 具有促進平滑肌表型轉化的作用。綜上，本研究數據提示PRMT5是VSMCs表型轉化和血管重塑的潛在干預靶標。

PRMT5 是催化蛋白質精氨酸殘基單甲基化和對稱二甲基化修飾的主要酶，可以催化多種組蛋白和非組蛋白底物，在組織穩態維持、疾病演進的關鍵過程中起重要作用。對組蛋白而言，PRMT5 對H4R3 和H3R8 的單甲基化和對稱二甲基化修飾方面的研究最為廣泛和深入。本課題組前期亦報道了PRMT5 通過對H4R3 的對稱二甲基化修飾，上調靶基因Filip1L 的轉錄和表達，抑制β-catenin 信號通路，從而發揮抗心肌肥大的保護效應[14]。在非組蛋白方面，PRMT5 的過度表達通過促進HoxA9 的對稱二甲基化修飾并抑制HoxA9的表達，抑制HoxA9與心肌肥大因子BNP 啟動子的結合，從而抑制心肌肥大[15]；心肌細胞中PRMT5 的缺失通過對蛋白OGA 的調控誘導擴張型心肌病，PRMT5 可通過調節OGA 的轉錄維持心臟穩態[16]；此外，通過介導NF-κB p65 的Arg-3 位點二甲基化，PRMT5 可在體外和體內促進VSMCs 中TMAO 誘導的炎癥反應[17]。目前，PRMT5 調節VSMCs 表型轉化的確切機制尚不清楚。PRMT5 介導的單甲基化和對稱二甲基化修飾，究竟發生在H4R3、H3R8 等組蛋白，或其他與VSMCs 表型調節相關的非組蛋白，仍有待進一步闡明。此外，綜合目前的文獻和已有數據，PRMT5 分子在不同的心血管疾病中扮演著截然不同的調控角色，其對不同心血管疾病的貢獻仍需進一步探索。

鑒于PRMT 家族在癌癥中的關鍵作用，關于PRMT家族成員的特異性抑制劑的研究正在全球范圍內開展，幾家大型制藥公司已經啟動了針對PRMT5 抑制劑在實體瘤和淋巴瘤的臨床試驗[18]。PRMT抑制劑的開發也為研究其對癌癥外的其它疾病的調控提供了便利。隨著PRMT5 作為心血管疾病靶標研究的深入，以及越來越多更強效更高特異性的PRMT5 抑制劑面世，靶向PRMT5 的心血管疾病藥物研發將會迎來更多的機遇。