色譜及質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)在食品真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用研究

黃志強(qiáng)

（鐘祥市公共檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖北鐘祥 431900）

真菌毒素是由真菌產(chǎn)生的具有毒性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其通常會(huì)影響食品或飼料的品質(zhì)和安全性，因此對(duì)人們的健康有一定的影響。同時(shí)，真菌毒素也是食品、農(nóng)產(chǎn)品、藥用植物及其制劑的重要污染源之一[1]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了400 種以上的真菌毒素，其中有200 多種產(chǎn)毒絲狀真菌，如曲霉屬、鐮刀菌屬和青霉屬[2]。黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉等某些菌株產(chǎn)生的一種毒素，含有B1、G1等羥基化代謝物，其中B1在糧食污染中較為常見(jiàn)，且其致癌性與毒性最強(qiáng)，容易導(dǎo)致肝癌。因此，黃曲霉素B1可作為食品安全性檢驗(yàn)的一個(gè)重要指標(biāo)。赭曲霉毒素是由鮮綠青霉、赭曲霉等代謝產(chǎn)生[3]，其中以赭曲霉毒素A的毒性最強(qiáng)，容易導(dǎo)致腸炎、腎病，甚至?xí)T發(fā)腎臟癌變。伏馬毒素是由串珠鐮刀菌等霉菌代謝所產(chǎn)生的一類真菌霉毒素，其中以伏馬毒素B 的毒性最強(qiáng)[4]。單端孢霉烯族化合物是由頭孢菌、鐮孢菌等代謝產(chǎn)生的有毒代謝物[5]。玉米赤霉烯酮是一種從禾谷鐮孢和其他鐮刀菌屬真菌中分解出來(lái)的次生產(chǎn)物，雖然毒性不強(qiáng)，但仍會(huì)對(duì)哺乳類動(dòng)物產(chǎn)生一定的致病性。在適宜的環(huán)境下，真菌毒素會(huì)侵染農(nóng)作物，對(duì)人與畜的健康造成了極大的威脅[6-7]。高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一種基于傳統(tǒng)色譜的分離分析方法，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)真菌毒素的定性與定量測(cè)定。然而傳統(tǒng)的HPLC 在抗干擾能力、通用性方面上的表現(xiàn)較差，因此液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Liquid Chromatograph Mass Spectrometer，LC-MS）技術(shù)得到了飛速發(fā)展。本文對(duì)食品中真菌毒素的檢測(cè)方法進(jìn)行了深入分析，旨在為食品中真菌毒素的安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)監(jiān)測(cè)提供理論與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

LC-20AT 型高效液相色譜儀，日本SHIMADZU公司；API 4000 Q Trap 質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源（ESI）：美國(guó)ABI 公司；振蕩器，上海康華生化儀器制造有限公司；高速離心機(jī)，美國(guó)BECKMAN公司；N-EVAP 水浴氮吹儀，美國(guó)OA 公司；Milli-Q 超純水器，美國(guó)Millipore 公司。

1.2 試劑與材料

黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、嘔吐毒素（Deoxynivalenol，DON）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、伏馬毒素B1（Fumonisin B1，F(xiàn)B1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、伏馬毒素B2（Fumonisin B2，F(xiàn)B2）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；甲酸﹑乙酸、甲醇和乙腈等均為色譜純；氯化鈉、氯化鉀﹑磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉等均為分析純；What-man 934-AH 玻璃微纖維濾紙；6 種毒素復(fù)合免疫親和柱。

1.3 方法

1.3.1 分析條件

（1）色譜條件。流動(dòng)相A（甲醇）、流動(dòng)相B（將1 nL 甲酸和0.0 771 g 的醋酸銨加水溶解后置于1 000 mL 的容量瓶中，并加入高純水定容至刻度線即得）[8]；色譜柱為C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：4 μL；流速0.3 mL·min-1。

（2）質(zhì)譜條件。離子源采用電噴霧離子源，其具有獨(dú)特的離子碰撞反應(yīng)，可以有效進(jìn)行元素分析。質(zhì)譜掃描方式采用多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，通過(guò)多個(gè)不同的反應(yīng)來(lái)監(jiān)測(cè)物質(zhì)的存在，可以實(shí)現(xiàn)多元素的檢測(cè)和分析。

1.3.2 樣品提取

糧食中多組分真菌毒素的萃取溶液主要為甲醇和乙腈等有機(jī)溶劑與水的混合溶液[7]。實(shí)驗(yàn)將兩種谷物混勻，使其粒度小于2 mm，選擇V乙腈∶V水∶V甲醇=80 ∶19 ∶1 的混合液作為提取液。稱取兩個(gè)25 g 的糧食樣品，加入100 mL 的萃取劑。在10 000 r·min-1以上的速度下快速均勻2 min，或在200 ～300 r·min-1的搖床上猛烈振動(dòng)30 min。然后以4 000 r·min-1的速度離心5 min，將試樣的上清液放進(jìn)潔凈的容器中。分別向離心后的殘?jiān)屑尤?00 mL 的V水∶V甲醇=20 ∶80 的混合溶液，再次進(jìn)行振蕩操作。再以4 000 r·min-1的速度離心5 min，將殘余物的上清移到上述的干凈的容器內(nèi)，混合搖勻?yàn)樯锨逡骸７Q取8 g NaCl、0.2 g KCl、0.2 g KH2PO4，以及1.16 g Na2HPO4·12H2O，用800 mL 的超純水溶解后，將其溶液定容到1 L，作為稀釋液。此外，取混合均勻的上清液10 mL加入70 mL稀釋液，混合均勻，再用微型濾紙濾取后，即可獲得提取物。

1.3.3 提取液凈化

為了降低探測(cè)過(guò)程中的干擾，提高實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的準(zhǔn)確度。在提取待測(cè)樣本前需要進(jìn)行凈化處理。改進(jìn)型固相萃取法的原理與固相萃取法相似，主要方法包括免疫親和柱（Immunoaffinity Chromatography，ICA）與多功能凈化柱（Multifunctional Column Cleanup，MFC）。ICA 又被稱為免疫親和色譜法，其利用抗原-抗體反應(yīng)，有選擇性地將被測(cè)物從復(fù)雜的環(huán)境中分離出來(lái)，再將抗體與不溶解的固體高分子進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，填充到色譜上[8]。此次實(shí)驗(yàn)利用免疫親和色譜法對(duì)樣品進(jìn)行純化，取提取液32 mL 上樣。復(fù)合免疫親和柱中液體排干后，上樣2 mL 洗脫劑，靜置3 min。然后以每秒1 滴的速度進(jìn)行洗脫，并將其置于5 mL的離心試管中，待洗脫液在復(fù)合免疫親和柱中放凈后，取1 mL 的洗脫放液，靜置3 min。再以每秒1 滴的速度進(jìn)行洗脫，并將收集到的洗脫液置于5 mL 的離心管中。按照V乙酸∶V甲醇=2 ∶98 的混合溶液進(jìn)行兩次洗脫。將所采集的洗提物在50 ℃用氮?dú)膺M(jìn)行干燥處理，并用1 mL 50%甲醇進(jìn)行定容，即可獲得待測(cè)液。

2 結(jié)果與分析

此次實(shí)驗(yàn)采用色譜及質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)對(duì)糧食承儲(chǔ)企業(yè)稻谷的真菌毒素進(jìn)行檢測(cè)。先對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，用微纖維濾紙過(guò)濾，得到提取液。然后用復(fù)合免疫親和柱對(duì)其進(jìn)行凈化處理，獲得待測(cè)液。最后以50%甲醇為溶劑制備6 種不同的混合標(biāo)準(zhǔn)液。如圖1所示，為6種真菌毒素的質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple Reaction Monitoring，MRM）色譜圖。

圖1 6 種真菌毒素MRM 色譜圖

由圖1 可知，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、黃曲霉毒素B1、伏馬毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A 和伏馬毒素B2這6 種真菌毒素的色譜峰峰形尖銳，分離度好，適合進(jìn)行定性定量。根據(jù)6 種真菌毒素在質(zhì)譜MRM 模式下的響應(yīng)強(qiáng)度，配制出不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照樣品前處理方法處理后，再進(jìn)行測(cè)定分析。

由表1 可知，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、黃曲霉毒素B1、伏馬毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、伏馬毒素B2這6 種真菌毒素的檢出限為0.5 ～50.0 μg·kg-1。取糧食承儲(chǔ)企業(yè)稻谷的空白糧食樣品，分別添加表1 中不同濃度的6 種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照樣品處理步驟進(jìn)行操作，得到的平均回收率與相對(duì)偏差值結(jié)果如表2 所示。

表1 6 種真菌毒素的檢出限

表2 6 種真菌毒素平均回收率與相對(duì)偏差值結(jié)算結(jié)果

由表2 可知，此次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的糧食樣品中6種真菌毒素加標(biāo)量在2 ～800 μg·kg-1時(shí)，平均回收率為75.5%～102.5%，批內(nèi)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.7%～9.7%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，研究采用色譜及質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)測(cè)得糧食承儲(chǔ)企業(yè)稻谷的毒素結(jié)果滿足食品理化檢測(cè)要求。

3 結(jié)論與討論

為了檢測(cè)食品中的真菌毒素和代謝物的污染情況，對(duì)真菌毒素的檢測(cè)流程以及各項(xiàng)操作步驟進(jìn)行分析，提出使用色譜及質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)對(duì)糧食承儲(chǔ)企業(yè)稻谷的真菌毒素進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，AFB1、DON、ZEN、OTA、FB1和FB2這6 種真菌毒素的色譜峰峰形尖銳，分離度好，適合進(jìn)行定性定量分析，其檢出限在0.5 ～50.0 μg·kg-1。6 種真菌毒素加標(biāo)量在2 ～800 μg·kg-1時(shí)，其平均回收率在75.5%～102.5%，批內(nèi)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.7%～9.7%。這表明研究采用色譜及質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)滿足食品理化檢測(cè)要求。