膜芯片法快速篩查即食果蔬中常見(jiàn)致病微生物方法的建立及應(yīng)用

鄒雨虹，楊丹妮，張曉金

（常州市食品藥品纖維質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇常州 213000）

水果和蔬菜富含各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有益于預(yù)防慢性疾病以及提高免疫力[1]。即食果蔬是指以新鮮水果和蔬菜為主要原料，經(jīng)過(guò)加工處理后，通過(guò)冷藏或低溫運(yùn)輸并進(jìn)入冷柜銷售的即食或即用的果蔬制品[2-3]。即食果蔬在流入市場(chǎng)前一般沒(méi)有經(jīng)過(guò)高溫加工等滅菌步驟，人們可以直接鮮切、涼拌食用，容易出現(xiàn)交叉污染繼而引發(fā)食源性疾病[4]，危害到人們的健康。其中，大腸埃希氏菌、單增李斯特菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌等致病微生物均在黃瓜、萵筍、苦苣、番茄、菠菜、瓜類、蘋(píng)果和梨等即食果蔬中檢出[5-6]。

目前針對(duì)即食果蔬中致病菌檢測(cè)的方法主要有傳統(tǒng)分離培養(yǎng)及生化鑒定、酶聯(lián)免疫吸附、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（主要為熒光定量PCR 法）、基因芯片法等[7]，常規(guī)的分離培養(yǎng)基及生化鑒定檢測(cè)方法仍是我國(guó)食品中常見(jiàn)致病菌檢測(cè)的主要方式[8]。但此方法耗時(shí)長(zhǎng)且步驟煩瑣，一般需要5 ～7 d 得出結(jié)果。考慮到果蔬保質(zhì)期極短的特殊性，檢測(cè)周期過(guò)長(zhǎng)會(huì)嚴(yán)重影響果蔬產(chǎn)品的快速流通，很大程度上加重了即食果蔬生產(chǎn)企業(yè)在儲(chǔ)藏及質(zhì)量管理上的負(fù)擔(dān)。

近年來(lái)出現(xiàn)的PCR 技術(shù)逐漸被應(yīng)用在食品中致病微生物的檢測(cè)中，該技術(shù)縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)靈敏度及檢測(cè)效率[9]，但無(wú)法利用一次實(shí)驗(yàn)操作同時(shí)對(duì)多種致病菌進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于目前生鮮果蔬流通不暢的問(wèn)題仍無(wú)法提供解決思路。因此，利用膜芯片檢測(cè)工作平臺(tái)開(kāi)發(fā)一種針對(duì)多種致病菌同步快速檢測(cè)的方法，對(duì)于即食果蔬行業(yè)的發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

膜芯片技術(shù)基于反向斑點(diǎn)雜交原理開(kāi)發(fā)，利用反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)（Reverse Dot Blot，RDB）將待測(cè)基因中的特異性序列作為探針固定在尼龍膜上，并采用生物素標(biāo)記的引物進(jìn)行基因的擴(kuò)增，同時(shí)將擴(kuò)增產(chǎn)物與固定在尼龍膜上的探針進(jìn)行雜交，經(jīng)化學(xué)顯色后可在雜交點(diǎn)上形成肉眼可見(jiàn)的信號(hào)，單次反應(yīng)即可同時(shí)篩查多種靶標(biāo)[10]。該方法的特別之處在于將多重PCR 技術(shù)與反向斑點(diǎn)雜交（RDB）技術(shù)相結(jié)合形成檢測(cè)體系，可以同時(shí)提取細(xì)菌和病毒中的DNA和RNA，同步擴(kuò)增特異性基因片段，在膜芯片上形成肉眼可見(jiàn)的檢測(cè)靶點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)所有靶標(biāo)的共同檢測(cè)。本文主要針對(duì)的即食果蔬中金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌O157、沙門(mén)氏菌、諾如病毒和輪狀病毒這6 種常見(jiàn)致病菌進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 樣品來(lái)源

本實(shí)驗(yàn)所用的樣本（即食生菜、即食黃瓜、鮮切牛油果、鮮切火龍果、蘋(píng)果、胡蘿卜、金橘、苦苣、鮮切菠蘿和鮮切羊角蜜）購(gòu)自各市場(chǎng)中。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株

細(xì)菌采用實(shí)驗(yàn)保存的陽(yáng)性菌株：沙門(mén)氏菌（CICC號(hào)21513）、 大腸埃希氏菌O157:H7（CICC 號(hào)21530）、金黃色葡萄球菌（CICC 號(hào)10384）、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（CICC 號(hào)21633），在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌株復(fù)蘇備用。病毒樣本采用購(gòu)買(mǎi)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品的形式進(jìn)行。

1.1.3 儀器與試劑

MFS-24 基因膜芯片檢測(cè)工作站（四川華漢三創(chuàng)生物科技有限公司）；Fresco17 高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司）；膜芯片檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：HT114B，四川華漢三創(chuàng)生物科技有限公司）；細(xì)菌DNA 提取試劑盒（貨號(hào)：DP302，天根生化科技有限公司）；病毒DNA/RNA 提取試劑盒（貨號(hào)：DP315，天根生化科技有限公司）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物及探針設(shè)計(jì)

通過(guò)查看文獻(xiàn)并結(jié)合實(shí)際結(jié)果，最終選取以下基因序列。引物和探針的設(shè)計(jì)由Primer Premier 5.0軟件完成，具體對(duì)應(yīng)的特異性基因詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 PCR 引物、探針信息

1.2.2 樣本前處理

樣本的前處理階段選用致病菌共增菌培養(yǎng)基，將待測(cè)樣品與6 種陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行前增菌。取共增菌培養(yǎng)基干粉5.96 g，加入蒸餾水至完全溶解，調(diào)節(jié)pH 值至7.2±0.2 并定容到100 mL，將滅菌鍋條件設(shè)置為121 ℃、20 min，滅菌后冷卻備用。無(wú)菌稱取10 g 待檢樣品，加入至100 mL 的增菌培養(yǎng)基中，設(shè)置恒溫振蕩培養(yǎng)箱參數(shù)為35 ℃和150 r·min-1，過(guò)夜培養(yǎng)。最后從共增菌液中取1 ～5 mL，提取DNA后進(jìn)行PCR 反應(yīng)。

1.2.3 樣品核酸制備

采用多重PCR 技術(shù)擴(kuò)增待檢靶標(biāo)，以高純度的基因組DNA 為模板，核酸樣品純度A260/A280在1.8 ～2.0 可保證多重PCR 反應(yīng)的擴(kuò)增效率；DNA樣品模板加入量≥200 ng 以保證檢測(cè)效果。使用細(xì)菌DNA 提取試劑盒或病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒分別進(jìn)行提取。

1.2.4 多重PCR 擴(kuò)增

（1）樣本核酸擴(kuò)增PCR 反應(yīng)體系為2×Multiplex PCR Master Mix 10 μL，OneStep EnzymeMix 0.45 μL，Hela cell total RNA 1 μL，樣品DNA 20 ～400 ng，最后用無(wú)核酸酶滅菌水補(bǔ)足20 μL。

（2）PCR 擴(kuò)增程序、溫度及反應(yīng)時(shí)間如表2 所示。

表2 PCR 擴(kuò)增程序表

1.2.5 膜芯片雜交

產(chǎn)物變性階段：將上述實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物在95 ℃變性5 min 使其解鏈后立即置于冰上備用；雜交儀設(shè)置：雜交儀在開(kāi)機(jī)前檢查瓶中的蒸餾水水位達(dá)到水位線，打開(kāi)基因膜芯片檢測(cè)工作站的電源和開(kāi)關(guān)，觀察廢液瓶是否空置，隨后打開(kāi)軟件，等待工作站顯示自檢成功后，點(diǎn)擊確定按鈕；使用耗材和試劑的準(zhǔn)備工作：使用前分別檢查試劑瓶BCDE 中的液體，如果存在結(jié)晶，則置于36 ℃水浴鍋中溶解至結(jié)晶消失后使用；將雜交試劑進(jìn)行分裝，準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量的雜交管并將200 μL B 液加入至每個(gè)雜交管中；芯片和樣品的加載：將準(zhǔn)備好的C ～J 試劑瓶開(kāi)蓋，取已加入樣品的雜交管及膜芯片放入工作站指定位置并確保一一對(duì)應(yīng)，隨后關(guān)閉試劑盤(pán)和反應(yīng)盤(pán)的蓋板及儀器倉(cāng)門(mén)，并再次檢查芯片與雜交管是否放置正確；運(yùn)行程序：加載“基因膜芯片檢測(cè)工作站標(biāo)準(zhǔn)雜交流程”，根據(jù)檢測(cè)樣品放置的位置選中相應(yīng)的按鈕，點(diǎn)擊“運(yùn)行”開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 結(jié)果判讀

實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效的前提是膜芯片上PC 點(diǎn)顯色，NC 點(diǎn)不顯色。反應(yīng)結(jié)果可用肉眼進(jìn)行判讀，也可參照膜芯片核酸分子雜交儀成像分析系統(tǒng)得出的結(jié)果。膜芯片點(diǎn)陣圖及多重PCR 陽(yáng)性質(zhì)控反應(yīng)結(jié)果如圖1和圖2 所示。

圖1 即食果蔬中常見(jiàn)致病微生物膜芯片點(diǎn)陣圖

圖2 即食果蔬中常見(jiàn)致病微生物多重PCR 陽(yáng)性質(zhì)控反應(yīng)結(jié)果圖

2 市售樣本檢測(cè)結(jié)果與分析

對(duì)市場(chǎng)中購(gòu)買(mǎi)的10 個(gè)即食果蔬樣本，提取其核酸，采用建立的膜芯片法進(jìn)行檢測(cè)鑒定，結(jié)果芯片圖如圖3 所示，灰色點(diǎn)表示該點(diǎn)位陽(yáng)性，無(wú)圓點(diǎn)則表示該點(diǎn)位陰性，同時(shí)還應(yīng)結(jié)合膜芯片點(diǎn)陣圖的基因序列進(jìn)行肉眼判讀。

圖3 市售樣本檢測(cè)結(jié)果芯片圖

在3 份樣本（即食生菜、即食黃瓜、金橘）中檢出了金黃色葡萄球菌，而單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌O157、沙門(mén)氏菌及諾如病毒、輪狀病毒未檢出；另外7 份樣本均未檢出此6 種致病微生物。結(jié)果表明，市場(chǎng)中售賣(mài)的即食果蔬存在被致病微生物感染的風(fēng)險(xiǎn)，通過(guò)建立的膜芯片法能夠達(dá)到多種致病菌的同步檢測(cè)。

3 討論

本項(xiàng)目將多重PCR 技術(shù)與反向斑點(diǎn)雜交（RDB）技術(shù)相結(jié)合形成檢測(cè)體系，同時(shí)提取6 種致病微生物提取的DNA 和RNA，并同步擴(kuò)增特異性基因片段，在膜芯片上顯示直觀的檢測(cè)靶點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)多種致病菌的同步檢測(cè)。本文建立的多重反應(yīng)體系中，利用特異性引物，可以在一次PCR 反應(yīng)體系中同時(shí)鑒別出金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、大腸埃希氏菌O157、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，以及諾如病毒、輪狀病毒這6 種致病菌，并且在48 h 內(nèi)能得出準(zhǔn)確結(jié)果。此方法快捷便利，檢測(cè)條件限制不多，能滿足PCR 實(shí)驗(yàn)環(huán)境的實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行檢測(cè)，并可實(shí)現(xiàn)一次操作同步檢測(cè)多種致病微生物，大大提高了檢測(cè)效率。

膜芯片法作為一種具備優(yōu)勢(shì)的檢測(cè)新方法，應(yīng)用于食品的致病菌快速篩查中，可以提供更為快速且準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，且無(wú)需耗費(fèi)大量人力資源。此方法有效解決了傳統(tǒng)分離培養(yǎng)基法耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)的問(wèn)題，有利于保障即食果蔬產(chǎn)品的順暢流通；有利于其他食品企業(yè)有效控制微生物污染風(fēng)險(xiǎn)，防止食源性疾病造成食品安全問(wèn)題；有利于食品安全監(jiān)管抽檢工作高效地進(jìn)行，為食品安全監(jiān)管工作提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。隨著基因膜芯片研究的不斷深入，相信膜芯片技術(shù)也會(huì)不斷發(fā)展，在食品致病性微生物的檢測(cè)中能得到更加廣泛的應(yīng)用。