高效液相色譜測定食品中固綠的前處理方法對比研究

許蕤竹

（上海華測品標檢測技術有限公司，上海 201114）

人工合成色素在生產過程中可能帶入有害物質，其本身過量使用也會對人體造成損害。《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）中對允許在食品中添加的人工合成色素的種類和限量有著明確的規定。

固綠是人工合成色素的一種，是一種酸性染料，能溶于水和酒精。固綠在中國澳門、日本、美國、加拿大等地區允許作為食品添加劑使用[1]，但在中國大陸不允許使用。國內有過進口食品中檢出固綠的報告，但目前國標中并沒有針對固綠的檢測方法。國內外用于測定合成色素的儀器方法主要有高效液相色譜法、高效液相色譜-質譜法等[2]，前處理方法有直接提取法、液-液萃取法、聚酰胺粉吸附法、固相萃取法等多種。本實驗采用高效液相色譜法測定食品中固綠的含量，為選擇出更合適的前處理方法，對比分析了不同前處理方法在檢測不同基質樣品時的優缺點，進而探索出更合適的檢測食品中固綠的方法，以達到高效、靈敏、省時和省材的目的。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

1260 高效液相色譜儀，配自動進樣器和DAD檢測器，美國安捷倫；CS501 恒溫水浴鍋，上海博迅；G3 垂熔漏斗，上海暢輝；CP413 分析天平：感量0.001 g，奧豪斯；AL204 分析天平：感量0.000 1 g，梅特勒；Vortex 3 渦旋混勻器，美國SI；KQ-100DB 超聲波清洗儀，上海圣科。

1.2 材料與試劑

固綠標準品（CAS：2353-45-9），德國Dr. E；實驗室用水為GB/T 6682 規定的一級水；正己烷（C6H14），分析純，國藥公司；三正辛胺-正丁醇溶液（5%），阿拉丁；乙醇-氨水-水混合溶液，7∶2∶1（體積比），上海安譜公司；甲醇（CH3OH），色譜純，上海安譜公司；鹽酸（HCL），分析純，國藥公司；聚酰胺粉（尼龍6）：過200 μm（目）篩，國藥公司；WAX固相萃取柱，150 mg/6 mL，艾杰爾公司；0.45 μm水相微孔濾膜，上海安譜公司。

1.3 標準溶液配制

（1）標準貯備溶液。準確稱取按照其純度折算為100%質量的固綠標準品0.1 g（精確至0.000 1 g），置于100 mL 容量瓶中，用pH 值為6 的水定容，配制成1.00 mg·mL-1的水溶液。

（2）標準使用溶液。臨用時，移取適量標準貯備溶液，加水稀釋至20 倍，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，配制成50 μg·mL-1的水溶液。

（3）標準曲線配制。精密量取適量標準使用溶液，用水稀釋，配制成濃度為5 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-1、30 mg·L-1和50 mg·L-1系列標準溶液，供高效液相色譜儀測定。以色譜峰面積為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.4 前處理方法

（1）直接提取法[3]。稱取樣品10 ～20 g（精確至0.001 g），加入60 ℃的熱水，用檸檬酸溶液調節pH 值至6，用水定容至50 mL，用超聲波清洗儀超聲提取20 min，6 000 r·min-1離心10 min，上清液過0.45 μm 水相濾膜，收集至進樣小瓶中，進高效液相色譜儀測定。

（2）液-液萃取法。稱取樣品10 ～20 g（精確至0.001 g）至分液漏斗中，加入2 mL 鹽酸、15 mL 三正辛胺-正丁醇溶液（5%），振搖分液漏斗提取，收集有機相，多次重復提取，直到有機相無色；合并有機相，用飽和硫酸鈉溶液洗3 次，將有機相放蒸發皿中，水浴濃縮至10 mL，再轉移至分液漏斗中，加入10 mL正己烷，加氨水溶液萃取3 次；合并氨水層，再用正己烷洗2 次，氨水層加入乙酸調成中性，水浴蒸發至近干，加水定容到5 mL。用0.45 μm 水相濾膜過濾，收集至進樣小瓶中，進高效液相色譜儀測定。

（3）聚酰胺粉吸附法。稱取樣品10 ～20 g（精確至0.001 g），加入60 ℃的熱水，用檸檬酸溶液調節pH 至6，取1 g 聚酰胺粉加少量水調成糊狀，倒入樣品溶液中，攪拌后用G3 垂熔漏斗抽濾，用pH 為4的60 ℃的水洗滌4 次；用甲醇-甲酸混合溶液洗滌4 次，然后用水洗至中性，加乙醇-氨水-水混合溶液（7 ∶2 ∶1，體積比）解吸，直到色素被完全解吸，解吸液中加乙酸中和，水浴蒸發至近干，加水定容到5 mL。用0.45 μm 水相濾膜過濾，收集至進樣小瓶中，進高效液相色譜儀測定。

（4）固相萃取法[4]。稱取樣品10 ～20 g（精確至0.001 g），用乙醇-氨水（70 ∶30，體積比）混合溶液定容，用超聲波清洗儀超聲提取20 min，6 000 r·min-1離心10 min，精確移取上清液20 mL 至蒸發皿中，水浴濃縮至5 mL左右，加入20 mL水稀釋；用5 mL 水反復沖洗蒸發皿，合并溶液后調節pH 至5，將溶液控制在1 mL·min-1左右的流速通過WAX 固相萃取柱，當溶液完全流出后，再用5 mL 含有0.05%甲酸的甲醇溶液淋洗WAX 固相萃取柱，最后用20 mL 含有4%氨水的甲醇洗脫，收集洗脫液，水浴蒸發至近干，加水定容到5 mL。用0.45 μm 水相濾膜過濾，收集至進樣小瓶中，進高效液相色譜儀測定。

1.5 儀器條件

色譜柱：C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：35 ℃；DAD 檢測器波長：635 nm[5]。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫表

2 結果與分析

2.1 儀器條件的優化

C8色譜柱和C18色譜柱都是常用的反向色譜柱，本試驗一開始為了縮短儀器分析時間，選擇C8色譜柱進行分析，固綠目標峰保留時間為5.476 min。但發現在分析復雜基質時，因干擾物質較多，C8色譜柱不能提供合適的分離度，故后續試驗更換了C18色譜柱，并通過多次調整流動相的梯度洗脫程序，使得固綠目標峰保留時間為10.154 min，目標峰附近的雜峰明顯減少，達到了很好的分離效果。

2.2 標準曲線、線性和檢出限

固綠標準曲線線性范圍在5 ～50 mg·L-1，曲線方程為y=23.541 8x-3.624 7，相關系數0.999 85。選擇空白基質加標試驗，根據3 倍信噪比計算出方法檢出限。直接提取法檢出限為1 mg·kg-1，液-液萃取法檢出限為2 mg·kg-1，聚酰胺粉吸附法檢出限為0.5 mg·kg-1，固相萃取法檢出限為0.3 mg·kg-1。

2.3 不同前處理方法對檢測結果準確度和精密度的影響

分別用4 種不同的前處理方法對果汁、配制酒、糖果和蜜餞等4 種不同基質樣品進行處理，做低（2 mg·kg-1）、中（5 mg·kg-1）、高（20 mg·kg-1）3 種濃度加標試驗，每個添加水平重復6 次。通過加標回收率來驗證檢測結果的準確度，結果的相對標準偏差來驗證方法的精密度，實驗結果見表2 和表3。

表2 果汁和配制酒試驗數據 （單位：%）

表3 糖果和蜜餞試驗數據 （單位：%）

2.4 直接提取法

直接提取法操作簡單、快捷，實驗時間短，所需試劑耗材成本低，可快速處理大量樣品。對于簡單基質如果汁和配制酒，加標回收率在72.7%～105.4%，相對標準偏差在3.54%～9.69%，有較好的準確度和精密度，滿足測試需求。但在處理較復雜的基質如糖果和蜜餞時，不能很好地去除干擾，數據波動較大，加標回收率在67.2%～113.5%，相對標準偏差在7.13%～16.78%，精密度不能滿足測試要求，色譜圖雜峰多影響定量結果。

2.5 液-液萃取法

液-液萃取法所用試劑較多，對實驗人員的操作水平有一定的要求。加標回收率在58.3%～82.6%，相對標準偏差在2.15%～10.22%，相對于其他3 個方法而言，數據準確度和精密度均不具有優勢，檢出限也是最高的，不予推薦。

2.6 聚酰胺粉吸附法與固相萃取法

聚酰胺粉吸附法的加標回收率在75.7% ～99.6%，相對標準偏差在2.40%～8.54%。固相萃取法的加標回收率在73.9%～106.2%，相對標準偏差在3.58%～8.65%。這兩個方法所得到的結果準確度和精密度基本一致，均能達到測試需求。特別在處理復雜基質如糖果和蜜餞時，數據明顯優于直接提取法和液-液萃取法，檢出限也能做到更低。相比較而言，聚酰胺粉法比固相萃取法操作簡單，且有明顯的價格優勢，故在處理復雜基質時優選聚酰胺粉吸附法。

3 結論

本研究利用高效液相色譜法對食品中固綠進行檢測，對比了不同前處理方法的優缺點，分析大量實驗數據，并從方法難易程度、測試效率、測試成本、數據準確度和穩定性等多個維度綜合考慮，得出以下結論。在處理相對干凈的液體基質時優先選擇直接提取法，該方法快速高效，成本低，數據可靠；在處理復雜基質時，聚酰胺粉吸附法有著明顯的優勢，操作簡便，成本相對較低，檢出限低，數據準確。