基因2型鵝星狀病毒EvaGreen熒光定量一步法RT-PCR的建立與應(yīng)用

趙 磊, 劉廷惠, 楊貝奇, 張留君, 劉欣超, 張訓(xùn)海

(安徽科技學(xué)院 家禽疫病防控監(jiān)測安徽省重點實驗室,安徽 鳳陽 233100)

鵝星狀病毒(Goose astrovirus,GoAstV)屬于星狀病毒科禽星狀病毒屬,是一類無囊膜的單股正鏈RNA病毒,其基因組全長7.1～7.4 kbp,包含3個開放閱讀框(ORF1a、ORF1b和ORF2),ORF2基因編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白以包裹核酸形成病毒衣殼,是GoAstV的基因分型依據(jù)[1-2]。GoAstV分為2種基因型(GoAstV-1和GoAstV-2),二者的衣殼蛋白氨基酸序列同源性僅為40.4%～41.7%。GoAstV-1型是以導(dǎo)致鵝腸炎的FLX株為代表株的經(jīng)典型鵝星狀病毒[3]。GoAstV-2型是近年來引發(fā)雛鵝以痛風(fēng)為主要病癥的新型鵝星狀病毒,其主要侵害4～20日齡的雛鵝,發(fā)病率可達(dá)80%,死亡率可達(dá)50%,病鵝因腎功能障礙導(dǎo)致內(nèi)臟、關(guān)節(jié)、肌肉等部位發(fā)生嚴(yán)重白色尿酸鹽沉積,耐過鵝易繼發(fā)細(xì)菌感染,后期生長緩慢,料肉比升高,出欄合格率顯著降低[4-6]。另有報道發(fā)現(xiàn)GoAstV-2感染番鴨、櫻桃谷鴨、雞并造成痛風(fēng)癥狀[7-9],表明它已具備跨越物種屏障的能力,成為我國養(yǎng)禽業(yè)面臨的重要疫病之一。

傳統(tǒng)RT-PCR方法屬于終點法,只能對病毒感染定性,不能定量,靈敏度也較低,而具備簡便、快速、高通量、高靈敏度等優(yōu)點的熒光定量RT-PCR方法被廣泛用于RNA病毒的定性與定量檢測。邱思語等[10]和白彩霞等[11]分別應(yīng)用SYBR Green I染料法建立了檢測GoAstV-2熒光定量RT-PCR方法,Wan等[12]、Yin等[13]和Yuan等[14]分別應(yīng)用TaqMan探針法建立了檢測GoAstV-2熒光定量RT-PCR方法。染料法相比探針法成本低,另外在探針法中,由于RNA病毒易突變,當(dāng)突變位點位于探針區(qū)域時,探針與模板結(jié)合能力下降而易導(dǎo)致假陰性結(jié)果影響其準(zhǔn)確性。……