基于HPLC指紋圖譜與多成分含量測定的凹葉景天正丁醇部位差異性研究*

葉梅芳,魏怡林,劉媛媛,江露娟,蒙雪雁,丘琴,2,甄漢深,黃鳳音,甄丹丹

(1.廣西中醫藥大學,南寧 530200;2.廣西優勢中成藥與民族藥開發工程技術研究中心,南寧 530200)

凹葉景天(SedumemarginatumMigo.)為景天科景天屬多年生肉質草本植物,別名馬牙半支、石板菜、打不死等。其始載于《本草綱目拾遺》[1],在《全國中草藥匯編》《湖南藥物志》《中國民族藥志要》《中華本草》《中藥大辭典》《四川中藥志》等也有記載。全草均可藥用,味苦、酸,性涼,歸心、肝經,具有清熱解毒、止血和平肝的作用,可用于治蛇咬傷、黃疸、跌打損傷等病癥。現代研究表明凹葉景天具有抗腫瘤[2-3]、抗氧化[4]、鎮靜催眠[5]、止血止痛[6]等藥理作用。目前,對凹葉景天的性狀鑒別、薄層鑒別[7-8]、紫外光譜鑒別[9-10]、化學成分預實驗[11]以及槲皮素、山奈素、異鼠李素、甘草苷等成分的含量測定[12-15]已有報道,但其質量標準尚未完善。中藥指紋圖譜作為中藥應用較為廣泛的質量評價模式之一,因其能夠體現中藥成分的整體性,所以在評價中藥材的質量時應用廣泛[16-17]。本課題組對凹葉景天乙酸乙酯部位進行了指紋圖譜與多成分含量測定研究[18],關于凹葉景天正丁醇部位的指紋圖譜和含量測定研究筆者尚未見報道。劉昌孝等[19]首次提出中藥質量標志物(Q-Marker)概念,Q-marker是與中藥的功能屬性密切相關,有明確的化學結構,是可以進行定性鑒別和定量測定的物質。沒食子酸具有抗腫瘤[20]、抗炎[21]、抗氧化[22]作用;原兒茶酸具有抗氧化[23]、抗菌[24]、保護急性肺損傷[25]、保護心肌缺血-再灌注損傷[26]等藥理作用;異槲皮苷具有抗氧化作用[27]。以上3種成分均與凹葉景天的功效和藥理作用相關,將其作為含量測定指標成分科學且合理,與中藥Q-marker的原則相符。為了科學評價凹葉景天,筆者在本研究采用指紋圖譜結合化學計量學,建立凹葉景天正丁醇部位的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜,并進行相似度評價、聚類分析、主成分分析研究,對凹葉景天正丁醇部位中的沒食子酸、原兒茶酸和異槲皮苷3個成分進行含量測定。報道如下。

1 材料與儀器

1.1材料 對照品:沒食子酸(中國食品藥品檢定研究院,批號:110831-201204,含量≥99%);原兒茶酸(中國食品藥品檢定研究院,批號:110809-200604,含量≥99%);異槲皮苷(成都曼斯特生物科技有限公司,批號:MUST-18051005,含量≥98%)。正丁醇(天津市大茂化學試劑廠,批號:20180401,AR);95%乙醇 (成都市科龍化工試劑廠,批號:20170901,AR);甲醇(成都市科隆化學科技有限公司,批號:2018082702,AR);色譜乙腈 (美國TEDIA公司,批號:18035148);色譜甲醇 (美國TEDIA公司,批號:17095090);磷酸為分析純;超純水。10個不同產地凹葉景天主要來源于廣西壯族自治區、浙江省和湖北省,經廣西一心醫藥有限責任公司馬利飛副主任中藥師鑒定為景天科景天屬植物凹葉景天(SedumemarginatumMigo.)的地上部分。藥材來源見表1。

表1 10個產地凹葉景天藥材來源

1.2儀器 KQ500DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);HWS-26電熱恒溫水浴鍋(上海齊欣科學儀器有限公司);DHG-9203A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海齊欣科學儀器有限公司);Waters e2695高效液相色譜儀,W2998PDA檢測器(美國Waters公司);Waters e2695型高效液相色譜儀,2489UV檢測器(美國Waters公司);Simplicity超純水系統(密理博中國有限公司);TGL-16G高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);SQP電子天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司,感量:0.1 mg]。

2 方法與結果

2.1色譜條件 色譜柱:Thermo ODS-2 HYPERSIL色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相為乙腈(D)-0.12%磷酸溶液(B);梯度洗脫(0～10 min,3%→4%D;10～22 min,4%→6%D;22～55 min,6%→12%D;55～95 min,12%→13.5%D;95～125 min,13.5%→22%D;125～130 min,22%→3%D);流速:0.8 mL·min-1;檢測波長:260 nm;柱溫:30 ℃;進樣量:5 μL。

2.2樣品的制備 取凹葉景天藥材粗粉150 g,用10倍量的70%乙醇浸泡30 min,回流提取3次,分別回流提取2,1.5,1 h,紗布過濾,合并提取液,于旋轉蒸發儀減壓濃縮,得到70%乙醇提取物濃縮液,再用正丁醇分別萃取6或7次,減壓濃縮后置于水浴鍋(<60 ℃)揮成浸膏,減壓干燥,制得正丁醇部位干浸膏樣品,置于干燥器中保存備用。

2.3溶液的制備

2.3.1對照品溶液的制備 稱取沒食子酸、原兒茶酸和異槲皮苷對照品適量,精密稱定,加甲醇溶解并定容,分別制成單一的對照品儲備液;精密吸取上述3個對照品儲備液制成濃度分別為沒食子酸0.092 0 mg·mL-1、原兒茶酸0.018 5 mg·mL-1、異槲皮苷0.275 8 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3.2供試品溶液的制備 取凹葉景天藥材正丁醇部位樣品0.1 g,精密稱定,置于2 mL離心管中,加甲醇超聲溶解,分別轉移到2 mL量瓶中并定容,轉移至2 mL離心管,于13 000 r·min-1下離心10 min(r=4 cm),經微孔濾膜(孔徑0.45 μm)濾過,即得。

2.4指紋圖譜的建立

2.4.1精密度實驗 取S1產地凹葉景天正丁醇部位樣品0.1 g,精密稱定,按“2.3”項方法制備供試品溶液,按“2.1”項色譜條件進樣于高效液相色譜儀,連續進樣測定6次,以12號峰異槲皮苷為參照峰(S),計算得到各色譜峰的相對保留時間RSD值為0.02%～0.35%,相對峰面積的RSD值為0.30%～1.81%,表明儀器的精密度良好。

2.4.2重復性實驗 稱取S1產地凹葉景天正丁醇部位樣品共6份,每份0.1 g,精密稱定,按“2.3”項方法制備供試品溶液,按“2.1”項色譜條件進樣,以12號峰異槲皮苷為參照峰,計算得到各色譜峰的相對保留時間RSD值為0.01%～0.61%,相對峰面積的RSD值為0.10%～3.04%,表明該方法的重復性良好。

2.4.3穩定性實驗 取S1產地凹葉景天正丁醇部位樣品0.1 g,精密稱定,按“2.3”項方法制備供試品溶液,按“2.1”項色譜條件分別于0,2,4,9,20,22,24 h進樣7次,以12號峰異槲皮苷為參照峰(S),計算得到各色譜峰的相對保留時間RSD值為0.02%～0.28%,相對峰面積的RSD值為0.69%～2.90%,表明供試品溶液的穩定性良好,實驗結果可靠。

2.4.4凹葉景天正丁醇部位指紋圖譜的建立及相似度評價 將S1～S10產地凹葉景天正丁醇部位樣品,按“2.3”項方法制備供試品溶液,按“2.1”項色譜條件進樣,得到10個不同產地樣品的HPLC指紋圖譜數據。將所得圖譜數據自動積分后導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012.1版軟件” ,設S1為參照圖譜,經過多點校正,自動匹配,采取Mark峰匹配色譜峰,以中位數法生成疊加圖和共有模式圖,共標定18個峰,通過與對照品對比,指認其中3個成分,分別是1號峰沒食子酸、2號峰原兒茶酸、12號峰異槲皮苷,結果見圖1、圖2。12號峰(異槲皮苷)分離度較好,保留時間適宜,可確定其為參照峰(S)。計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積,結果見表2、表3。各共有峰相對保留時間的RSD值為0.10%～0.53%,表明各產地間樣品共有峰出峰時間較穩定,而相對峰面積的RSD值為35.08%～124.75%,說明不同產地凹葉景天正丁醇部位指紋圖譜中的色譜峰之間的相對峰面積不同,各化學成分含量差異較大。相似度評價結果見表4,各產地樣品的相似度在0.702～0.974,表明各產地凹葉景天正丁醇部位樣品的質量相對穩定,其化學成分基本一致,各成分含量差異較大。其中浙江寧海(S1)、浙江麗水(S2)與湖北巴東縣(S10)產地相似度相對較低,而其他產地樣品相似度相對較高,均>0.837。

圖1 凹葉景天色譜峰圖

1.沒食子酸;2.原兒茶酸;12.異槲皮苷。

表2 10個產地凹葉景天正丁醇部位樣品共有峰相對保留時間

表3 10個產地凹葉景天正丁醇部位樣品共有峰相對峰面積

表4 10個產地凹葉景天正丁醇部位指紋相似度結果

2.5統計分析

2.5.1聚類分析 運用SPSS 21.0版統計軟件將10個不同產地凹葉景天正丁醇部位的樣品原始數據,采用組間聯接聚類方法,進行SPSS聚類分析,聚類結果見圖3。當判別距離為5時,藥材聚為3類,S1、S2為一類,S6、S7為一類,剩余的S3、S4、S5、S8、S9、S10為一類。聚類分析發現,10個不同產地凹葉景天正丁醇部位樣品存在一定的差異,該差異可能與采收的季節、氣候、土壤等外界因素有關。

圖3 10個產地凹葉景天正丁醇部位樣品聚類分析圖

2.5.2主成分分析 將10個不同產地的凹葉景天正丁醇部位的18個共有峰的峰面積導入SPSS 21.0統計軟件,進行主成分分析。計算特征值及貢獻率,結果見表5,以特征值>1為提取原則,特征值>1的主成分有4個,方差貢獻率分別為54.449%,18.142%,11.002%,9.884%,累計的總方差貢獻率為93.447%,較全面地體現出凹葉景天正丁醇部位化學成分的基本特征。主成分分析得分圖見圖4,10個不同產地的凹葉景天正丁醇部位樣品分為3類,S1為一類,S2、S3、S4、S5、S6、S7為一類,S8、S9、S10為一類,其結果與聚類分析結果存在差異。載荷矩陣結果見表6,主成分的貢獻大小取決于載荷的絕對值大小。由表6可知,峰3,5,11,12在主成分1有較高的載荷,峰2,12在主成分2有較高的載荷,峰8在主成分3有最高的載荷,峰7,14在主成分4有最高的載荷,說明峰2,3,5,7,8,11,12,14對凹葉景天的質量貢獻較大。峰2、峰12分別指認出為原兒茶酸和異槲皮苷,提示可將其作為凹葉景天的質量控制指標。推測使凹葉景天質量產生差異的不是單一的成分,可能是多個成分協同作用的結果。

圖4 10個產地凹葉景天正丁醇部位樣品主成分分析得分圖

表5 凹葉景天正丁醇部位主成分分析的特征值與貢獻率結果

表6 凹葉景天正丁醇部位主成分分析成分旋轉矩陣

2.6樣品含量測定

2.6.1專屬性實驗 為排除空白試劑干擾,以甲醇為供試品溶液,按“2.1”項色譜條件進樣,結果表明甲醇溶劑對色譜峰的出峰情況沒有干擾。

2.6.2線性關系考察 稱取沒食子酸、原兒茶酸、異槲皮苷對照品適量,精密稱定,制成濃度分別為沒食子酸1.061 mg·mL-1、原兒茶酸0.226 81 mg·mL-1、異槲皮苷0.342 81 mg·mL-1的混合對照溶液,用甲醇逐級稀釋成一系列不同濃度的混合對照品溶液,按“2.1”項色譜條件進樣測定。以進樣濃度(X)為橫坐標,峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線,結果見表7。

表7 凹葉景天中3個成分線性關系考察結果

2.6.3精密度實驗 精密吸取同一混合對照品溶液,按“2.1”項色譜條件連續進樣6次,依法測定沒食子酸、原兒茶酸、異槲皮苷的色譜峰峰面積,計算得RSD分別為1.37%,1.41%,1.43%,表明儀器精密度良好。

2.6.4穩定性實驗 取S1產地凹葉景天正丁醇部位樣品0.1 g,精密稱定,按“2.3”項下的方法制備供試品溶液,按“2.1”項下的色譜條件分別于供試品溶液制備后 0,2,4,9,20,22,24 h進樣,依法測定各色譜峰峰面積,計算得沒食子酸、原兒茶酸、異槲皮苷RSD分別為0.90%,2.49%,0.66%,表明供試品溶液穩定性良好。

2.6.5重復性實驗 稱取S1產地凹葉景天正丁醇部位樣品共6份,每份0.1 g,精密稱定,按“2.3”項下的方法制備供試品溶液,以“2.1”項下色譜條件測定,依法測定各色譜峰峰面積,計算含量,計算得沒食子酸、原兒茶酸、異槲皮苷的RSD值分別為1.97%,1.82%,2.01%,表明該方法的重復性良好。

2.6.6沒食子酸、原兒茶酸、異槲皮苷加樣回收實驗 取已知含量的S1產地凹葉景天正丁醇部位樣品共6份,每份0.05 g,精密稱定,按“2.3”項方法制備對照品溶液及供試品溶液,每份加入適量混合對照品溶液,以“2.1”項下色譜條件測定,計算得平均回收率分別為97.43%,97.38%,100.25%,RSD分別為3.02%,1.38%,2.59%。

2.6.7沒食子酸、原兒茶酸、異槲皮苷樣品含量測定 取10個不同產地凹葉景天正丁醇部位樣品0.1 g,按“2.3”項方法制備對照品溶液及供試品溶液,按“2.1”項色譜條件進樣,依法測定各樣品峰面積,根據外標法計算10個不同產地中沒食子酸、原兒茶酸、異槲皮苷的含量,結果見表8。

表8 10個不同產地凹葉景天正丁醇部位樣品中3種成分的含量測定結果

3 討論

3.1指紋圖譜結果分析 本研究采用HPLC法建立10批凹葉景天正丁醇部位的指紋圖譜,標定18個共有峰,指認其中3個成分,分別為沒食子酸、原兒茶酸、異槲皮苷。除了浙江寧海(S1)、浙江麗水(S2)與湖北巴東縣(S10)產地外,其他產地樣品相似度均>0.837,表明樣品中的化學成分一致性較好。聚類分析與主成分分析都將樣品分為3類,兩者的分類結果卻不盡相同,有差異,這可能是由于主成分分析所提取出的主成分還沒能完全反映藥材的全部信息有關[28-29]。同時,主成分分析載荷圖提示特征性成分沒食子酸、原兒茶酸、異槲皮苷在區分凹葉景天正丁醇部位指紋圖譜中占有重要地位。沒食子酸、原兒茶酸、異槲皮苷幾個成分都具有一定藥理活性,且其藥理活性與凹葉景天的功效相關,為進一步研究凹葉景天藥材中化學成分與藥效的相關性以及藥材資源開發和質量控制提供研究基礎。凹葉景天藥材分布于全國大部分地區,本研究由于實驗時間限制等因素影響,未能采集和購買到更多其他省份和產地的凹葉景天藥材,在今后的研究中可增加更多全國其他地區的藥材進行研究,增加凹葉景天質量控制與評價的可靠性,確保其建立指紋圖譜的廣泛性,使研究結果更具有代表性。

3.2含量測定結果分析 本研究所測得10個不同產地凹葉景天正丁醇部位樣品中的3種成分的含量存在一定的差異,且10個不同產地凹葉景天正丁醇部位樣品中沒食子酸、原兒茶酸、異槲皮苷含量的高低順序大體上呈現出:異槲皮苷>沒食子酸>原兒茶酸,且3種成分中原兒茶酸、異槲皮苷含量最高產地為浙江寧海,沒食子酸含量最高的產地為廣西隆安縣。廣西龍勝產地沒食子酸含量最低,為0.275 4 mg·mL-1。湖北巴東縣產地的原兒茶酸含量最低,為0.0320 mg·mL-1。廣西武鳴產地的異槲皮苷含量最低,為0.647 7 mg·mL-1。

中藥指紋圖譜具有整體性和模糊性兩大特征,中藥材組成成分復雜,具有多樣性和可變性,且成分間相互作用具有難以預測性。凹葉景天正丁醇部位指紋圖譜相似度評價是對不同產地凹葉景天正丁醇部位質量整體性和一致性的評價,相似度結果體現的是凹葉景天藥材正丁醇部位各方面的平均水平,相似度低說明該產地的凹葉景天與其他產地的凹葉景天存在較大差異,但差異的產生因素不一定是含量的差異,可能是多方面的影響。如本實驗相似度評價結果與含量測定評價結果中顯示S1產地相似度低,但指標成分含量高。同時凹葉景天含量存在差異也受多種因素影響,生境因子(經緯度和海拔)、生長性狀等因素與指標成分含量積累關系密切[30],產地、氣候條件、采收時間和季節等各種因素影響,也會造成不同產地間藥材含量差異大。

綜上所述,合適的生境因子(經緯度和海拔)及生長性狀、合適的產地、采收時間和氣候條件等對獲得較高質量的藥材有重要意義。本研究中不同產地凹葉景天正丁醇部位質量差異大,說明了對凹葉景天藥材的質量評價方法不能從某一個指標或幾個指標對其進行質量控制,且凹葉景天用藥多以整體入藥,為保證其用藥療效及能整體表征凹葉景天的成分和質量差異,在今后的研究中應尋找更多遵循中藥質量標志物原則的指標成分進行同時測定,提高凹葉景天質量的一致性與可控性。

本研究以10個不同產地的凹葉景天為研究對象,通過HPLC法建立凹葉景天正丁醇部位的指紋圖譜模式并結合化學計量學對凹葉景天進行質量評價分析,建立HPLC法同時測定凹葉景天正丁醇部位中沒食子酸、原兒茶酸和異槲皮苷3個成分的含量。該研究方法操作簡便,結果可靠,精密度、重復性、穩定性較好,為凹葉景天活性成分的研究奠定實驗基礎,為進一步研究該藥材成分與藥效的相關性,以及為凹葉景天的開發利用和質量評價奠定基礎。