山地虎耳草質量控制方法研究*

蘇媛,劉安平,劉學良,李維業,劉海青,石春蘭,問靜,王永晶,牛貴姍,王開祥,韓達斌,楊增亮,祁彥凱

(1.西寧市食品藥品檢驗檢測中心,西寧 810007;2.青海省藥品審評核查中心,西寧 810007)

山地虎耳草在《中國植物志》[1]、《青海植物志》[2]、《青海經濟植物志》[3]《中華藏本草》[4]均有記載,為虎耳草科虎耳草屬山地虎耳草SaxifragamontanaH.Smith的干燥全草[1]。其藏語名為“塞仁交木”[1]、“塞交塞保”[3]、“塞迥色保”[4],生長于海拔3200～4800 m的灌叢和高山草甸,青海省內主產于海北、海南、黃南、玉樹、果洛等州及東部農業區;甘肅、陜西南部、西藏、四川西部和云南北部也均有分布[3]。于每年7—8月采花或全草,洗凈,晾干[4],全草入藥,消炎鎮痛,治頭痛頭傷等。經項目組調研整理發現,虎耳草屬山地虎耳草在青海、甘肅、西藏等地區也常被歸為“蒂達”(俗稱“藏茵陳”)類藥材使用[5]。目前,關于山地虎耳草化學成分研究方面的文獻較少,主要集中在藥材資源整理、調查等方面[6-13],筆者尚未發現其有效成分分離鑒定、質量控制等方面的文獻報道,而“蒂達”類藥材,如黃花獐牙菜、篦齒虎耳草的主要成分研究報道中涉及金絲桃苷及當藥醇苷等成分的含量測定[8,14-15]。本研究建立薄層色譜法鑒別金絲桃苷,高效液相色譜法同時測定金絲桃苷、當藥醇苷含量的測定方法,為山地虎耳草的質量控制提供依據。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀,Waters 2998 PDA detector型二極管陣列檢測器(美國沃特斯有限公司);ME204電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司,感量:0.1 mg];XS105DU分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司,感量:0.01 mg);SB25-12DT新芝超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司);Milli-Q2355超純水機(美國密理博公司)。

1.2試劑 金絲桃苷對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:111521-201809,含量:94.9%);當藥醇苷對照品(成都普菲德生物技術有限公司,批號:19041505,含量:99.27%)。甲醇(色譜純,德國默克股份兩合公司,批號:I1148507118),乙腈(色譜純,德國默克股份兩合公司,批號:JA098730),磷酸(色譜純,上海安譜科學儀器有限公司,批號:20510018),其余試劑為分析純;水為超純水;硅膠GF254預制薄層板(青島海洋化工有限公司,批號:20211221)。

1.3樣品 12批實驗用山地虎耳草藥材均由項目組人員分別于青海貴德縣拉脊山、湟中縣、同德縣、互助縣采集,經青海省藥品審評核查中心劉海青主任藥師鑒定。樣品來源見表1,各批樣品經粉碎后過孔徑(355±13) μm(三號)篩密封保存備用。

表1 山地虎耳草來源

2 方法與結果

2.1金絲桃苷薄層色譜鑒別 分別取樣品粉末約1.5 g,加丙酮30 mL,超聲處理(250 W,50 kHz)20 min,濾過,濾液蒸干,殘渣加甲醇1 mL使溶解,作為供試品溶液。再取金絲桃苷對照品,加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液,作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則0502)實驗,吸取上述13種溶液各5 μL,分別點于同一硅膠GF254薄層板上,以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(20：12：4：4)上層溶液為展開劑,展開,取出,晾干,噴以含1%亞硝酸鈉的1%甲醇溶液,加熱至斑點顯色清晰,置紫外光燈(波長365 nm)下檢視。結果見圖1。供試品色譜中,在與金絲桃苷對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的熒光斑點。

1.對照品;2～13.山地虎耳草樣品(SDHEC1～SDHEC12)。

2.2金絲桃苷和當藥醇苷含量測定

2.2.1色譜條件與系統適用性實驗 Waters SunFire C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),以乙腈為流動相A,水(含0.05%磷酸)為流動相B,進行梯度洗脫(0～10 min,90%→88% A;10～20 min,88%→85% A;20～25 min,85%→82% A;25～30 min,82%→76% A;30～35 min,76%→45% A;35～37 min,45%→40%A;37～40 min,40%→90%A;40～45 min,90% A);流速為1.0 mL·min-1;檢測波長:254 nm;柱溫:30 ℃;進樣量:10 μL。在此色譜條件下金絲桃苷、當藥醇苷與樣品中其他成分分離度均>1.5,理論板數按金絲桃苷、當藥醇苷峰計算分別不低于83 000和23 000。見圖2。

A.空白溶劑;B.對照品;C.樣品;1.金絲桃苷;2.當藥醇苷。

2.2.2對照品儲備溶液的制備 取金絲桃苷對照品和當藥醇苷對照品,精密稱定,分別為0.049 82 g和0.018 12 g,置10 mL量瓶,加甲醇超聲使溶解,并稀釋至刻度,搖勻,即得。對照品儲備溶液濃度分別為4.982,1.812 mg·mL-1。

2.2.3供試品溶液的制備 分別取“1.3”項下制備的樣品粉末約0.2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25.00 mL,稱定質量,超聲處理30 min(功率250 W,頻率50 kHz),取出,放至室溫,再稱定質量,用甲醇補足減失質量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。

2.2.4線性關系考察 分別精密吸取“2.2.2”項下金絲桃苷和當藥醇苷對照品儲備溶液各0.25,0.50,1.00,1.50,2.00,3.00 mL,置50 mL量瓶中,加甲醇定容,搖勻,制成混合對照品溶液,按“2.2.1”項下色譜條件進行分析,以峰面積積分值(Y)為縱坐標,對照品進樣量(X)為橫坐標,繪制標準曲線,金絲桃苷、當藥醇苷的回歸方程、相關系數分別為Y=2 987 259.52X-2 091.48(r=0.999 9),Y=6 665 003.60X-558.68(r=0.999 9)。進樣量分別在0.124 6～1.494 6 μg,0.045 3～0.543 6 μg范圍內與峰面積積分值呈良好的線性關系。

按“2.2.1”項下色譜條件進行分析,當信噪比(S/N)為3時對各組分最低檢出限進行測定,當S/N為10時對各組分定量限進行測定,結果表明金絲桃苷、當藥醇苷的最低檢出限分別為0.498,0.272 ng,定量限分別為1.993,0.680 ng。

2.2.5精密度實驗 精密吸取“2.2.4”項下對照品混合溶液,按“2.2.1”項下色譜條件進行分析,連續進樣6次,計算峰面積RSD分別為金絲桃苷0.65%,當藥醇苷0.60%(n=6)。結果表明儀器精密度良好。

2.2.6穩定性實驗 取“2.2.3”項下同一供試品溶液(樣品編號:SDHEC11),分別在0,2,4,8,16,24 h按“2.2.1”項色譜條件進行分析,進樣體積均為10 μL,記錄峰面積,結果金絲桃苷峰面積RSD為0.32%,當藥醇苷峰面積RSD為1.59%(n=6)。結果表明供試品在24 h內穩定性良好。

2.2.7重復性實驗 取山地虎耳草樣品(樣品編號:SDHEC11)6份,按“2.2.3”項下方法制備成供試品溶液,按“2.2.1”項色譜條件進行分析,測定金絲桃苷、當藥醇苷的平均含量分別為0.438 3%,0.003 8%,RSD分別為0.77%,2.03%(n=6)。結果表明該方法重復性良好。

2.2.8回收率實驗 取山地虎耳草樣品(樣品編號:SDHEC11)6份,每份約0.1 g,精密稱定,置錐形瓶中;精密量取“2.2.2”項金絲桃苷和藥醇苷對照品儲備溶液1.25,0.10 mL,置10 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻;分別在6份供試品中精密加入上述対照品混合溶液1.00 mL,按“2.2.3”項方法制成供試品溶液,按“2.2.1”項色譜條件進行分析,測得金絲桃苷、當藥醇苷的量,計算加樣回收率,平均回收率分別為93.01%,90.95%;RSD分別為0.72%,1.27%(n=6)。結果表明該方法的回收率良好。

2.2.9樣品含量測定 分別取“1.3”項下制備的樣品粉末約0.2 g,精密稱定,按“2.2.3”項下方法制備成供試品溶液,然后按“2.2.1”項色譜條件進行分析,經二極管陣列檢測器檢測檢測以上2種待測成分,比對樣品與對照品紫外光譜一致后,按外標法以峰面積積分值計算,得2種待測組分的百分含量,見表2。

表2 山地虎耳草中金絲桃苷和當藥醇苷含量測定結果

3 討論

3.1指標成分的選擇 本項目前期研究對山地虎耳草進行化學成分分離分析,成功分離出獐牙菜苦苷、綠原酸、當藥苷、金絲桃苷和當藥醇苷5種成分。分析結果顯示,12批樣品中僅3批檢出當藥苷,不同批次的樣品5種成分的含量質量分數分別是0.026 6%～0.245 2%,0.032 1%～0.389 6%,0.017 1%～0.057 1%,0.201 4%～0.762 8%和0.004 1%～0.227 3%,其中獐牙菜苦苷和綠原酸雖然平均含量較大,但不同批次樣品中含量差別顯著。相比之下,選擇金絲桃苷和當藥醇苷2種成分作為檢測指標,對山地虎耳草的實驗室質量控制、生產加工和臨床用藥指導更有實際意義。

另一方面,在藏、蒙醫藥臨床應用中,山地虎耳草被廣泛作為“蒂達”類常用藥材,全草入藥,具有清熱利膽、舒肝健胃、解毒等功效,臨床上常用于治療急性黃疸型肝炎、膽囊炎、流行性感冒等疾病[16];現代藥理實驗證明金絲桃苷能顯著提高抗氧化酶的活力,在保護心腦缺血-再灌注損傷的同時,能增強免疫,保護肝臟,抗抑郁[17-18],還具有抗乙型肝炎病毒[19-20]、抗炎癥與抗血栓作用[21];當藥醇苷主要功能是減輕肝細胞的損傷,有效抑制炎癥遞質(腫瘤壞死因子)的形成,減輕細胞間質的炎癥反應,促進受損肝細胞的修復[22];這與山地虎耳草的臨床主治功能相吻合。

綜合上述原因,最終確定以金絲桃苷作為薄層鑒別定性檢測指標、金絲桃苷和當藥醇苷作為山地虎耳草的定量檢測指標。

3.2薄層色譜鑒別的考察 針對不同極性提取溶劑(甲醇、丙酮、乙酸乙酯),不同提取方法(冷浸、超聲、回流),不同提取時間(10,20,30 min),不同展開劑[三氯甲烷-甲醇-水-冰醋酸(65：35：4：1),乙酸乙酯-冰醋酸-水(8：1：1),乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(10：6：1：2)的上層溶液],不同顯色劑(5%亞硝酸鈉的5%甲醇溶液、三氯化鋁試液),不同薄層板(硅膠G薄層板、硅膠GF254薄層板、聚酰胺薄膜)進行比較考察。根據色譜分離效果、斑點顯色結果,最終確定適宜的樣品制備方法和薄層色譜展開條件,該條件重復性較好,層析的結果穩定,斑點清晰一致。

3.3含量測定色譜系統的優化

3.3.1測定波長的選擇 采用光電二極管陣列檢測器(DAD)對樣品進行全波長190～800 nm掃描,對不同波長下色譜圖中金絲桃苷和當藥醇苷的出峰情況、峰形大小、吸收峰的數量及強弱進行對比分析,結果發現在波長254 nm下檢測時,上述2種化學成分可以較好地表達,因此選擇254 nm為檢測波長。

3.3.2色譜柱的選擇 采用3種C18色譜柱,Waters SunFire(4.6 mm×150 mm,5 μm)、Shimadzu Inertsil ODS-SP(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Waters XBridge(4.6 mm×250 mm,5 μm),分離金絲桃苷和當藥醇苷,結果發現分離效果均較好、分離度及理論板數均達到要求,因此選擇保留時間短的色譜柱。

3.3.3流動相體系的選擇 采用3種不同梯度體系分離金絲桃苷和當藥醇苷,綜合比較分離效果、峰形大小等因素,最終確定以第2種梯度體系即“2.2.1”項下梯度體系作為流動相。

3.3.4提取溶劑比較 采用甲醇、丙酮、乙酸乙酯3種溶劑,取樣品粉末約0.2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入上述溶液25.00 mL,稱定質量,超聲處理30 min。結果表明甲醇提取效率最高,因此選用甲醇作為提取溶劑。

3.3.5提取時間比較 取樣品粉末約0.2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25.00 mL,分別采用超聲15,20,30,45 min提取。結果表明提取時間45 min較30 min,提取出含量并無顯著上升,因此選超聲提取30 min作為提取時間。

3.4結果分析 測定結果顯示,不同產地、不同批次,以及不同采收期山地虎耳草中金絲桃苷、當藥醇苷的含量有一定差異。青海互助縣的樣品中金絲桃苷含量普遍較高,3份樣品平均含量為0.691 1%;當藥醇苷含量較高的樣品均產于青海同德縣,該產地5份樣品平均含量為0.102 2%;表明山地虎耳草生長的地理位置環境對其有效成分含量有一定影響,可考慮在上述區域進行采收。采收于果期的樣品3中兩種成分的含量明顯較低,可考慮應在花期進行采收。

后續研究中將在采收時記錄產地坐標和采收期的詳細信息,進一步分析不同產地及不同采收期對山地虎耳草中金絲桃苷、當藥醇苷含量差異的影響,并繼續擴大采樣范圍,增加樣品批次,對顯微鑒別、水分、灰分及浸出物項目進行質量控制方法的探索,初步建立山地虎耳草的質量標準。

雖然各地在“蒂達”的臨床使用方面已有習用藥材及特色的治療體系,且大部分地區已找到合適的優勢基原品種替代品,但由于藏區部分地區交通不便以及各民族語言差異等,各地市場流通、醫療機構及制藥企業使用的基原植物并不統一[23];同時,有關藥材的質量、等級、有效性與安全性仍缺乏統一完善的評價標準,導致臨床用藥沒有統一規范,藥材及成藥制劑出現混用亂用現象[24],存在一定的用藥安全風險,為了確保更加有效、安全的臨床用藥,本文建立 “蒂達”類常用藥材山地虎耳草的薄層色譜定性鑒別法,并采用高效液相色譜法,建立同時測定山地虎耳草中金絲桃苷和當藥醇苷2種成分的定量分析方法。本研究結果利用現代檢驗檢測技術手段,對傳統藏藥材進行定性、定量分析,能夠客觀、科學、快速、準確地作出評價,對山地虎耳草藥材的生產加工、臨床使用和質量控制均具有一定的參考價值,為“蒂達”類藥材的綜合質量評價及質量標準化的研究提供了實驗數據,也為廣大人民群眾的用藥有效性和安全性提供前期理論研究依據。