外周血單個核細胞及移植活檢組織中他克莫司濃度與全血濃度和不良反應及臨床療效相關性研究進展*

郭朋朋,張蕊,劉亞妮,師少軍,2

[1.華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院藥學部,武漢 430022;2.武漢市江夏區第一人民醫院(協和江南醫院)藥學部,武漢 433000]

第2代鈣調磷酸酶抑制劑(calcineurin inhibitor,CNI)他克莫司(tacrolimus,TAC),作為器官移植術后預防排斥反應的重要免疫抑制劑,由于治療窗窄和較高的藥動學變異性,臨床常常需要以治療藥物監測(therapeutic drug monitoring,TDM)調整個體用藥劑量[1]。盡管器官移植受者一定程度上受益于TDM,但存在新的臨床問題:全血TAC在治療窗內,仍然發生排斥反應[2]。事實上,TAC經腸道吸收后,主要分布在紅細胞內(約85%),14%分布在血漿中,一小部分(<1%)進入含有淋巴細胞的外周血單個核細胞中[3]。TAC靶向作用于T淋巴細胞,通過與細胞溶質受體FKBP12結合抑制鈣調神經磷酸酶的活性,阻斷活化T細胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)去磷酸化和核轉位,抑制細胞因子表達以及抑制淋巴細胞活化,從而降低免疫反應。研究表明,患者性別、年齡、紅細胞沉降率[4]、細胞色素P450(CYP3A4、CYP3A5)、藥物轉運體(ABCB1)基因多態性等因素均可影響全血TAC濃度[5],從而導致個體間差異。基于TAC的TDM臨床應用存在的問題以及全血TAC在個體間較大差異:血藥濃度的監測并不能準確反映其在體內靶細胞的分布情況。研究者們提出檢測淋巴細胞和移植組織內TAC濃度以替代全血濃度,以達到精準監測的目的,從而實現臨床TAC個體化用藥。外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells ,PBMCs)作為一種易于獲取的基質,已用于研究淋巴細胞內TAC濃度[6]。除此以外,同種異體移植物組織活檢樣本也作為TAC的TDM潛在輔助基質進行類似的研究[7]。本綜述主要闡述血液、PBMCs以及移植物中TAC濃度的相關性,以及其與鈣調磷酸酶活性、排斥反應及TAC相關腎毒性之間相關性,為濃度-藥效提供證據,從而達到臨床個體化用藥的目的。

1 PBMCs、移植活檢組織中TAC濃度與全血濃度相關性

上述研究均表明PBMCs內TAC濃度與全血TAC濃度之間存在有限的相關性,這可能是由于患者體內PBMCs組成改變、患者性別、紅細胞沉降率、體內代謝酶CYPs及轉運體ABCB1基因多態性等因素[21-22]對TAC在體內的分布與處置產生影響。因此,在對PBMCs與全血TAC濃度進行相關性分析時,應將上述因素納入考慮以減少個體間變異性。

1.2移植活檢組織中TAC濃度與PBMCs、全血濃度相關性 早期CAPRON等[9]對90例肝移植患者中肝組織內TAC濃度進行檢測分析,結果發現肝內C0與全血穩態濃度并無相關性,但發現PBMCs內TAC濃度與肝內濃度在移植后第5天后開始相關(P<0.05)。但之后BODNAR-BRONIARCZYK等[23]研究發現,全血TAC濃度與肝臟或腎臟器官中TAC濃度之間不存在相關性(P=0.151 9,n=50;P=0.391 8,n=50)。與NOLL等[24]報道結論一致,腎臟組織TAC 濃度的變化似乎反映血液中的變化,但當日全血TAC和腎臟TAC濃度之間并沒有相關性。ZHANG等[25]觀察到52例患者腎移植后3個月TAC組織濃度和全血濃度之間具有相關性(n=52,r=0.356 0,P=0.009 6),而在1年后并未發現兩者之間存在關聯性(n=22,r=0.336 8,P=0.125 3)。SALLUSTIO等[26]在該研究中,對132例腎移植患者口服TAC劑量、全血TAC濃度及組織TAC濃度進行相關性研究,結果發現口服劑量與全血濃度(r=0.15,P=0.048)、口服劑量與組織濃度(r=0.41,P=5.8×10-9),以及全血濃度與組織濃度(r=0.44,P=7.4×10-10)存在顯著正相關。

以上試驗均顯示全血TAC濃度與組織內TAC濃度之間具有較弱的相關性,研究人員從多方面來解釋可能的機制及原因。根據目前對免疫抑制治療期間藥物遺傳學的研究,在肝移植患者中發現CYP3A5基因型與TAC劑量需求之間的關聯是一致的[27-28];另一方面,TAC在移植組織中分布將受到藥物轉運體表達和多態性的密切調節,如ABCB1的活性和表達水平可能導致TAC吸收和排泄的變異性[29-30],甚至更可能影響TAC在同種異體移植物中的組織分布和藥物效應或毒性[27,31-33]。由于試驗中無法確保所有活檢組織均為同一位置,以及無法排除器官移植后發生缺血-再灌注損傷從而影響CYP3A5表達差異[34-35],供受體基因多態性[36]、代謝酶與轉運體在腎、肝及其他器官中表達活性差異,因此兩者之間相關性較差。

2 PBMCs、移植組織中TAC濃度與排斥反應相關性

2.1PBMCs內TAC濃度與排斥反應相關性 隨著PBMCs內濃度檢測方法的開發,研究者同時聚焦于PBMCs內TAC濃度是否可直接預測臨床排斥反應的發生。CAPRON等[9]發現,90例肝移植患者術后,與無至輕度組織學排斥反應(BANFF評分<6)的53例患者比較,出現中度至重度排斥反應(BANFF評分>6)的37例患者在術后第3,5,7天時PBMCs內TAC濃度顯著降低,在第7天時肝內TAC濃度同樣顯著性下降,而這兩組在全血濃度上并沒有表現出差異,即在術后第7天移植患者肝內和PBMCs內TAC濃度與BANFF評分呈顯著相關,相關系數r分別為0.720 3,0.900 3,而平均血藥濃度與BANFF評分無關。LEMAITRE等[17]報道1例患者發生急性排斥反應,該患者在第1,7天時PBMCs內TAC濃度較其他9例未出現排斥反應患者低約4倍,而全血TAC AUC0-12h接近平均值(分別為81.3,70.0 nghmL-1)。FRANCKE等[15]在175例腎移植患者發現,隨著移植術后時間延長,雖然全血與PBMCs內TAC濃度相關性在改善,但全血TAC或PBMCs內TAC在移植后第3個月時,與臨床排斥反應的發生均無關。隨后,2022年研究中詳述PBMCs內濃度、CD3內濃度、CD14內濃度與有無發生排斥反應均無關聯[20]。

盡管檢測PBMCs內TAC濃度作為臨床TDM的補充,但前述無論是肝移植、腎移植甚至心臟移植患者,其體內PBMCs內TAC濃度與臨床排斥反應或組織學結果相關性較弱或無相關性,只有1例肝移植患者在發生急性排斥反應時其體內PBMCs內TAC濃度較其他未發生患者低。

2.2移植組織中TAC濃度與排斥反應相關性 SANDBORN等[37]提出實體器官移植后同種異體移植物的原位免疫抑制劑可能比全身免疫抑制更重要。在其開展的臨床試驗中顯示,與9例肝移植術后發生早期細胞排斥反應的患者比較,10例無排斥反應患者肝組織中TAC的中位數顯著升高。肝組織中TAC濃度<100 ng·g-1對細胞排斥反應的敏感性為78%,特異性為72%。液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)用于分析移植組織中TAC濃度越來越多。CAPRON等[38]建立LC-MS/MS法來準確定量測定肝移植組織中TAC濃度,該方法線性范圍為5～500 pg·mg-1組織。在術后第7天對146例患者進行全血(酶免疫)及移植組織中TAC濃度的檢測,未發生或發生輕度排斥反應(BANFF評分<6,n=67)患者全血TAC濃度與中重度排斥反應(BANFF評分>6,n=79)比較,全血濃度無差異的情況下肝組織中濃度顯著下降。BANFF評分與肝內TAC濃度之間存在一級指數相關性(r2=0.98,P=0.002)。BODNAR-BRONIARCZYK等[23]對肝、腎移植組織中TAC進行分析定量。結果顯示:在腎移植患者中,未發生或輕度排斥反應患者(n=43)活檢組織TAC濃度為(88.9±41.3) pg·mg-1,中度至重度排斥反應患者(n=7)為(23.1±8.1) pg·mg-1;全血濃度分別為(7.1±1.9) ,(7.8±2.1) ng·mL-1;在肝移植患者中,未發生或輕度排斥反應(n=44)患者活檢組織TAC濃度為(109.2±45.7) pg·mg-1,中度至重度排斥反應患者(n=6)為(28.3±7.8) pg·mg-1;全血濃度分別為(7.4±2.3),(6.9± 1.7) ng·mL-1(P<0.001)。可得出低TAC濃度與BANFF評分>6之間的關系具有統計學意義(肝移植患者:P=0.006 9;腎移植患者:P=0.002 1)[23]。這與CAPRON等[9]結論一致,發生排斥反應肝移植患者活檢組織中TAC濃度低于未發生者(P<0.05),而全血差異無統計學意義,即肝內TAC與全血水平無相關性,排斥反應嚴重程度與肝內TAC濃度相關。但ZHANG等[25]未發現腎移植組織內TAC濃度或者組織濃度/全血濃度比值與經活檢證實的急性排斥反應具有關聯。SALLUSTIO等[26]再次驗證腎組織TAC濃度與排斥反應之間沒有關聯。在ZHANG與SALLUSTIO[25-26]兩項研究中,患者聯用TAC、霉酚酸及潑尼松龍以達到免疫抑制,分別有21%,44%移植患者發生排斥反應。這些結果與之前的肝移植結果形成對比,即腎組織內TAC濃度與急性排斥反應的發生沒有相關聯系。

在肝移植患者中表現出移植組織濃度與排斥反應的相關性,這在腎移植患者中未觀察到。主要原因在于上述研究中肝移植患者僅接受TAC單藥治療,中度至重度排斥反應發生概率較高,而腎移植患者均接受TAC、霉酚酸、類固醇三聯療法來達到免疫抑制治療。主要說明TAC不能夠完全抑制淋巴細胞的活化,間接證明三聯療法能夠起到降低TAC相關不良反應且更好的免疫抑制作用。

3 全血、PBMCs內TAC濃度與鈣調磷酸酶活性(CNA)相關性

鈣調磷酸酶作為TAC最終藥效學評價指標,目前關于該酶活性測定的方法主要有:酶聯免疫吸附測定(ELISA)、超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)等。LEMAITRE等[17]對10例肝移植患者術后第1,7天全血TAC、PBMCs內TAC以及CNA進行PK-PD關系研究。第1天與第7天全血TAC與CNA AUC0-12 h無顯著相關性(P=0.92,0.10);PBMCs 內TAC與CNA AUC0-12 h之間亦未發現相關性(P=0.71,0.88)。TRON等[16]對32例肝移植患者進行全血、PBMCs內TAC濃度及CNA進行測定,發現CNA與TAC全血或PBMCs內濃度均無關聯,即PBMCs內TAC濃度與藥效學關系在本研究中并未體現。HAN等[11]對214例腎移植患者穩定期全血TAC濃度與PBMCs內TAC濃度比值與T細胞活化之間的關系進行研究,結果發現PBMCs內TAC濃度與T細胞反應性程度密切相關。對于全血TAC濃度,相關性也是一致的,但與PBMCs內TAC比較,相關性不大。FONTOVA等[39]研究25例腎移植患者服用TAC后CNI和CNA的AUC與全血及PBMCs內TAC濃度關系,結果發現全血內TAC濃度和CNA之間存在顯著相關性,而PBMCs內TAC濃度和CNA之間相關性未被調查。

通過上述研究可發現,全血內TAC及PBMCs內TAC濃度與CNA抑制作用或者淋巴細胞活化可能具有一定相關性,并且與全血比較,似乎PBMCs內TAC濃度與CNA或淋巴細胞活化關系更顯著。因此,如何更精確檢測PBMCs內CNA是目前亟待解決的問題。

4 全血、PBMCs、移植活檢組織內TAC濃度與腎毒性相關性

TAC相關腎毒性是TAC常規使用的重要不良反應之一。HAN等[11]對214例腎移植患者進行回顧性研究,提出在移植后6個月內,PBMCs穩態濃度與腎毒性之間無顯著相關性。FRANCKE等[15]發現52例在移植術后出現TAC相關腎毒性的腎移植患者與未發生腎毒性患者相比差異無統計學意義(兩組全血TAC濃度中位數分別為7.3,7.8 ng·mL-1,P=0.38;PBMCs內TAC濃度中位數:26.5,27 pg·106cells,P=0.91)。這兩組患者術后第3個月PBMCs/全血TAC比率同樣差異無統計學意義。SALLUSTIO等[26]發現9例發生急性腎毒性移植患者活檢組織中TAC濃度較未發生急性腎毒性移植患者高,即組織內高TAC與急性腎毒性的發生存在正相關。總之,目前臨床證據表明PBMCs內TAC濃度在預測腎毒性方面應用價值不高,只有SALLUSTIO研究表明移植腎組織內高TAC濃度與腎毒性存在相關性,需要在前瞻性研究中得到確認。

5 結束語

綜上所述,PBMCs內TAC濃度與全血TAC濃度進行相關性分析時,應將多因素(年齡、性別、CYPs、ABCB1等)納入考慮。僅有一項臨床試驗表示PBMCs內TAC與移植活檢組織中TAC濃度對術后急性排斥反應具有很強預測性,尚未在其他肝臟移植臨床試驗中被重復,因該研究中患者采用TAC單藥作為免疫抑制,已不適用于目前臨床應用。一些研究說明PBMCs內TAC濃度與T細胞活化/CNA之間的顯著相關性,有關靶細胞內CNA的準確檢測是目前TAC藥效學評價的難點。僅有一項研究報告腎移植組織TAC濃度與急性腎毒性具有相關性,但由于急性腎毒性發生概率太小,需要在大樣本研究中進行驗證。盡管針對PBMCs內及移植組織中免疫抑制劑濃度的研究已然深入至代謝酶CYP3A4、3A5、轉運體ABCB1等基因多態性、紅細胞壓積、性別、口服劑量等,但其作為臨床預測急性排斥反應或腎毒性的臨床意義具有局限性。并且,大多數臨床研究均由于回顧性、樣本量較小、統計能力不足等限制,結果都存在一定局限性。因此,需要設計多中心、多樣本量的前瞻性臨床研究以確定PBMCs內或移植組織內TAC濃度是否比當前臨床TDM具有更加顯著的臨床意義。群體藥動學[40-41]模型作為一種穩定策略可作為目前臨床劑量選擇的參考方式,可以同時評估顯著的協變量因素,如紅細胞沉降率、性別及其他可影響TAC代謝轉運等,已達到個體化給藥的臨床目的。