藏藥四臣顆粒大鼠口服給藥13周長期毒性研究*

高曉新,胡宇馳,趙晉燕,曹春然,張碩峰,李雪梅

(1.北京市藥品檢驗(yàn)研究院,國家藥品監(jiān)督管理局創(chuàng)新藥物安全研究與評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中藥成分分析與生物評價北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102206;2.北京市藥品包裝材料檢驗(yàn)所,北京 100035;3.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 100102)

四臣顆粒是西藏藏醫(yī)藥大學(xué)研制的復(fù)方制劑,處方組成為甘草、豬毛蒿、螃蟹甲、巖白菜等,功能主治為清熱解毒、止咳平喘、潤喉祛痰,用于治療上呼吸道感染、慢性支氣管炎急性發(fā)作,其藥效作用得到相關(guān)研究證實(shí)[1-5]。此方人日用量擬定相當(dāng)于生藥材36.1 g,療程為2周～1個月。參照國家食品藥品監(jiān)督管理局的《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》(局令第34號)[6]和 “藥物重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則”[7],實(shí)驗(yàn)采用大鼠連續(xù)13周每天給藥1次,觀察供試品對大鼠的毒性反應(yīng),明確其毒性反應(yīng)的癥狀和程度,確定其毒性靶器官和無毒反應(yīng)劑量,為臨床安全用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1供試品 四臣顆粒由A公司提供;批號:2101003,2110001;性狀為黃棕色至棕色、帶氣香、味甜、微苦的顆粒;規(guī)格為每袋9 g(相當(dāng)于生藥18.05 g)。

1.2動物 無特定病原體(SPF)級SD大鼠128只,雌雄各半,雄鼠175.8～204.9 g;雌鼠159.9～189.2 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供,實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016-0011,動物使用許可證號:SCYK(京)2020-0041,實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證編號:110011211107447356,110011211107447436。飼養(yǎng)條件:屏障環(huán)境,溫度20～26 ℃;相對濕度40%～70%,換氣次數(shù)為>15次·h-1,照明時間是10 h(明)/14 h(暗)。

1.3主要試劑 測定試劑盒:葡萄糖(Glu,批號:AUZ8730);丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT,批號:AUZ8785);天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST,批號:AUZ8787);堿性磷酸酶(ALP,批號:AUZ9238);尿素(Urea,批號:AUZ9270);肌酐(Crea,批號:2625);總膽紅素(T-BiL,批號:AUZ8983);總膽固醇(CHO,批號:AUZ7539);白蛋白(Alb,批號:AUZ9285);總蛋白(TP,批號:AUZ9297);三酰甘油(TG,批號:AUZ9154);肌酸激酶(CK,批號:AUZ9272);γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶(GGT,批號:AUZ9172);以上血清生化及電解質(zhì)分析相關(guān)試劑由貝克曼庫爾特實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(蘇州)有限公司及Beckman Coulter Inc生產(chǎn)。PEROX SHEATH(批號:51248),PEROX 1(批號:51250),PEROX 2(批號:51252),PEROX 3(批號:51254),HGB(批號:56812,05700),RBC/PLT(批號:81805,05693),BASO(批號:81803,05691),auto RETIC(批號:75550),EZ WASH(批號:47553),DEFOAMER(批號:24384,85486),SHEATH/RINSE(批號:71329);以上血液分析試劑是美國Siemens Healthcare Diagnostics Inc.生產(chǎn)。活化的部分凝血活酶時間(APTT)測定試劑盒(批號:N1108457)、凝血酶原時間(AP)測定試劑盒(批號:N0100860),均由美國Instrumentation Laboratory Co.生產(chǎn)。尿分析陰性/陽性質(zhì)控試紙(批號:C0338090),尿十項(xiàng)試紙[批號:(10)104061],尿液分析試劑由西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品有限公司生產(chǎn)。

1.4主要儀器 Beckman AU480全自動生化儀(儀器編號:070010);ADVIA 2120i全自動血細(xì)胞分析儀(儀器編號:H11002);Clinitek Status尿液分析儀(儀器編號:060023);ACL ELITE PRO全自動血凝分析儀(儀器編號:090090),GFJY-01B交直流檢眼鏡(儀器編號:藥19001);奧林巴斯BX53光學(xué)顯微鏡(儀器編號:190117)。

1.5實(shí)驗(yàn)方法 適應(yīng)性飼養(yǎng)6 d后,按大鼠體質(zhì)量隨機(jī)分為陰性對照組(N)和四臣顆粒大(H)、中(M)、小(L)劑量組,N組灌胃純化水,H、M和L組分別灌胃相當(dāng)于生藥33.12,20.98和8.83 g·kg-1(相當(dāng)于擬定臨床人用劑量的55,35和15倍)。每天上午給藥1次,連續(xù)給藥13周,停藥恢復(fù)4周。體質(zhì)量前4周每周測定2次、第5～13周每周測定1次;給藥前和給藥后0.5～4 h內(nèi)各觀察1次。攝食量每周測定1次。

給藥結(jié)束,雄性L組9只,其余每組各10只,恢復(fù)4周后每組取大鼠6只留尿,眼科檢查,取血并剖檢留取標(biāo)本,進(jìn)行尿常規(guī)、血液學(xué)和血清生化學(xué)檢測、臟器稱定質(zhì)量和組織病理學(xué)檢查。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。尿液學(xué)計(jì)數(shù)指標(biāo)采用秩和檢驗(yàn);其他數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示,首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),如果方差不齊性進(jìn)行Dunnett-t檢驗(yàn),如果方差齊進(jìn)行單因素方差分析。血液學(xué)指標(biāo)給藥結(jié)束,雄性L組9只,其他組10只,恢復(fù)期各組6只。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1一般狀況和眼科檢查、體質(zhì)量及攝食量

2.1.1大鼠一般狀況及眼科檢查 4組大鼠行為活動和外觀體征等一般癥狀及眼科檢查未見明顯異常。給藥期間L組雄性灌胃異常死亡大鼠1只。

2.1.2體質(zhì)量 給藥后0.5周,H組雌雄大鼠體質(zhì)量增長緩慢(P<0.05),隨著給藥時間的延長,H組體質(zhì)量增長更加緩慢(P<0.01),M組也逐漸出現(xiàn)體質(zhì)量增長緩慢現(xiàn)象。停藥后體質(zhì)量逐漸恢復(fù)正常。見圖1。

A.雄性;B.雌性。

2.1.3攝食量 給藥期間雄性H劑量組第3—6周和第10周攝食量增加(P<0.05或P<0.01);雌性在給藥第1周M、H組,第3周L組和第7周H組攝食量下降(P<0.05或P<0.01)。恢復(fù)期均無差異。見圖2。

A.雄性;B.雌性。

2.2血液學(xué)和凝血指標(biāo) 給藥結(jié)束雄性H組RBC、HGB和HCT均降低(P<0.01),M組RBC降低(P<0.05)。雌性H組RBC、HGB、HCT、MCHC均降低(P<0.05或P<0.01)、MCV、MCH、RDW均升高(P<0.05或P<0.01),M組RBC降低、MCV和MCH升高(P<0.01)。各給藥組RETIC存在劑量-效應(yīng)相關(guān)性升高(P<0.01)。停藥4周后雄性MCV、MCH升高(P<0.01),其余數(shù)值均恢復(fù)正常。給藥結(jié)束凝血指標(biāo)雄性H組PT升高(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠在不同期別血液學(xué)和凝血指標(biāo)檢測結(jié)果

2.3血清生化學(xué)和電解質(zhì) 給藥結(jié)束,與N組比較,雌性H組血糖升高(P<0.05),L、M、H組AST降低(P<0.05或P<0.01),H組CHO顯著升高(P<0.01),雄性M、H組T-BiL升高(P<0.05)。恢復(fù)期,雄性H組GLU升高(P<0.01)。給藥結(jié)束雌性大鼠血鉀M組降低(P<0.05)、恢復(fù)期雄性H組升高(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠在不同期別血清生化和電解質(zhì)指標(biāo)結(jié)果

2.4尿液學(xué)檢查結(jié)果 給藥結(jié)束雄性M、H組膽紅素顯著升高(P<0.05),具有劑量-效應(yīng)關(guān)系,見表3。個別組其他指標(biāo)如尿比重、潛血和白細(xì)胞有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但無生物學(xué)意義。

表3 4組大鼠不同期別尿膽紅素的變化

2.5臟器系數(shù) 給藥結(jié)束雄性給藥組肝臟系數(shù)增大(P<0.05或P<0.01),雌性M,H組肝臟系數(shù)增大(P<0.01);雄性M、H組腎臟、雌性H組腎臟系數(shù)增大(P<0.01)。雄性個別組腦、睪丸、附睪差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但不具有生物學(xué)意義。恢復(fù)期所有臟器系數(shù)均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

表4 4組大鼠在不同期別臟器系數(shù)指標(biāo)檢測結(jié)果

續(xù)表4 4組大鼠在不同期別臟器系數(shù)指標(biāo)檢測結(jié)果

2.6組織病理學(xué) 給藥結(jié)束各給藥組胸骨和股骨骨髓出現(xiàn)極輕到中度的紅系造血功能明顯活躍,且具有劑量-效應(yīng)關(guān)系;各給藥組脾臟髓外造血增多,雄性有劑量-效應(yīng)關(guān)系。H組部分腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)存在極輕到輕度的棕黃色大小不等的色素顆粒。停藥4周上述病變完全恢復(fù)。見圖3—4。

A.N組;B.L組; C.M組;D.H組。

A.N組;B.H組。

3 討論

藏藥四臣顆粒連續(xù)灌胃大鼠13周,給藥期間中、大劑量組體質(zhì)量增長緩慢,雌性大劑量組攝食量減少、雄性大劑量組攝食量卻增多。上述現(xiàn)象說明,雌性因給藥濃度和體積偏大影響攝入量而導(dǎo)致體質(zhì)量增長緩慢,雄性體質(zhì)量增長緩慢則可能與灌胃四臣顆粒影響營養(yǎng)物質(zhì)的正常吸收利用有關(guān)。給藥結(jié)束M、H組RBC、HGB、HCT等多個紅系相關(guān)指標(biāo)顯著降低,但在正常值范圍內(nèi)[8],不能診斷為貧血,但動物營養(yǎng)攝入和吸收利用受到供試品的影響,初步推斷動物會有因營養(yǎng)不良而影響紅系造血的可能。給藥組反應(yīng)性RETIC升高且超過正常值,以及組織病理學(xué)檢查中髓內(nèi)外造血增多,都驗(yàn)證可能會形成營養(yǎng)不良性貧血[9]。恢復(fù)期雄性MCV、MCH差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但在正常值范圍內(nèi),無生物學(xué)意義。

雄性M、H組及雌性H組腎臟系數(shù)顯著增大(P<0.01),組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)H組部分動物腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)存在極輕到輕度的棕黃色大小不等的色素顆粒;但腎功能指標(biāo)未見異常。這與文獻(xiàn)報道的腎臟的組織病理學(xué)病變一般先于臨床病理學(xué)指標(biāo)出現(xiàn)[10],實(shí)驗(yàn)室動物常規(guī)HE染色可觀察色素沉積的病理變化相同[11]。恢復(fù)期腎臟改變完全恢復(fù)。本研究中供試品為黃棕色至棕色中藥,推測腎臟改變?yōu)楣┰嚻飞刂貜?fù)給藥在腎臟沉積所致,與供試品毒性無關(guān),但提示長期使用需要監(jiān)測腎功能指標(biāo)。

給藥結(jié)束給藥組肝臟系數(shù)不同程度增大,結(jié)合供試品清肝利膽作用[5]、動物體質(zhì)量增長緩慢、肝臟組織病理和血液生化卻無異常改變等綜合判斷,與供試品無直接毒性相關(guān)。給藥結(jié)束雄性M、H組血清T-BiL升高(P<0.05),但數(shù)值在正常范圍內(nèi),可能與供試品清肝利膽的作用有關(guān)[5];產(chǎn)生多排除多,導(dǎo)致相應(yīng)組動物尿膽紅素顯著升高,沒有毒理學(xué)意義。個別組其他指標(biāo),如尿的比例、潛血和白細(xì)胞、血糖、PT、血鉀變化無生物學(xué)意義。

綜上所述,藏藥四臣顆粒大鼠灌胃給藥13周,RETIC的升高和髓內(nèi)外造血增多平衡紅系中RBC、HGB、HCT等指標(biāo)降低,使其在正常值范圍內(nèi)。另外,H組腎小管上皮細(xì)胞棕黃色顆粒為中藥色素重復(fù)給藥在腎臟沉積所致。初步判斷,大鼠灌胃13周四臣顆粒相當(dāng)于生藥33.12 g·kg-1及以下劑量沒有明顯毒性。長期服用四臣顆粒可影響大鼠營養(yǎng)物質(zhì)攝入和吸收利用以及腎臟色素沉積,建議嚴(yán)格控制臨床用藥時間,同時監(jiān)測血液學(xué)和腎功能相關(guān)指標(biāo)。