蒼耳亭與肝癌細胞MHCC97H共培養后細胞外泌體測序及功能分析*

吳育,汪潔,魏晨旭,張碩,李偉東

(1.南京中醫藥大學南通附屬醫院藥劑科,南通 226000;2.南京中醫藥大學藥學院,南京 210023;3.南京中醫藥大學泰州分校,泰州 225300)

侵襲轉移是肝癌的基本特征,也是影響肝癌治療效果的關鍵因素。肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者存活率非常低,只有9%患者在診斷后存活>5年[1]。蒼耳亭(xanthatin)是20世紀60年代從蒼耳(XanthiumstrumariumL.)中分離得到的一種天然倍半萜內酯化合物。研究表明,蒼耳亭對肝癌、結腸癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、宮頸癌和皮膚癌等具有顯著的抗腫瘤活性[2-4]。蒼耳亭對肝癌裸鼠有明顯的抑制腫瘤作用,并且抑制上皮-間質轉化來阻礙腫瘤發展[5-6]。轉錄因子Sal樣蛋白4(Sal-like protein-4 ,SALL4)在調控miR-146a-5p進而影響HCC外泌體和M2極化中起到至關重要的作用[7]。肝癌細胞分泌的外泌體miR-103通過靶向多種內皮連接蛋白增加血管通透性并促進腫瘤轉移[8]。

外泌體是直徑30～150 nm的囊泡,由內吞過程產生,并由多囊體(MVBs)與質膜融合分泌。幾乎所有類型的細胞在生理和病理條件下都會釋放外泌體。外泌體是腫瘤細胞與其微環境相互作用的重要載體,它攜帶多種生物活性物質,包括mRNA、miRNA、蛋白質等。腫瘤外泌體可以相互作用,被癌細胞本身或存在于腫瘤微環境或遠離腫瘤部位的其他細胞所吸收,產生不同的作用[9]。MicroRNAs (miRNAs)越來越被認為是代謝、癌癥、程序性細胞死亡或細胞分化等的可行治療靶點。蒼耳亭抗腫瘤是否與腫瘤外泌體有關筆者尚未見報道,在本研究通過高通量miRNAs測序,篩選蒼耳亭與MHCC97H共培養過程中差異miRNAs,并對其進行驗證,希望為尋找治療肝癌靶點提供有價值的線索。

1 材料與方法

1.1藥物與試藥 蒼耳亭由南京中醫藥大學李偉東教授實驗室提供,經過磁共振及X射線單晶衍射證實是化合物蒼耳亭,其純度達98%。人高轉移性肝癌細胞系MHCC97H購于武漢大學。達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM,Sigma-Aldrich,批號:D5796) ;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,BI公司,批號:04-001-1ACS) ;青霉素G 鈉鹽(Sigma-Aldrich 公司,批號:69-57-8) ;硫酸鏈霉素鹽 (AMRESCO 公司,批號:2018382 );二甲亞砜(DMSO,Solarbio公司,批號:D8370)。

1.2儀器 二氧化碳(CO2)培養箱(Thermo Scientific,型號:3131);超凈工作臺(ESCO Class ⅡBSC,型號:ESCOAC2);倒置熒光顯微鏡(德國ZEISS公司,型號:Vert.A1);電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司,型號:BSA224S-CW);測序分析儀 4000(美國Illumina公司)。

1.3外泌體的提取和測定 細胞MHCC97H培養于含5% FBS、100 U·mL-1青霉素、100 g·mL-1鏈霉素的DMEM中,在相對濕度5%的CO2培養箱中培養。在所有實驗中,蒼耳亭均溶解于DMSO中,終濃度5 μmol·L-1。5 μmol·L-1蒼耳亭處理細胞24 h。實驗分為對照組即未共培養的MHCC97H細胞組(含0.5% DMSO)和蒼耳亭與MHCC97共培養細胞組。采用差速離心(4 ℃下,500×g離心5 min,200×g離心30 min,10 000×g離心60 min)收集上清液。用孔徑0.22 μm無菌過濾器濾過后,加入超高速離心管中,以4 ℃,120 000×g離心70 min,棄去上清液。最后,根據沉淀量,加入200～400 μL預冷無菌PBS重懸懸液,為高純度EVs。

1.4外泌體的鑒定

1.4.1透射電鏡鑒定外泌體 用PBS 1 mL清洗EVs 3次。加入2%鋨酸溶液0.5 mL,4 ℃固定2 h后沖洗。分別用50%、70%、80%、90%乙醇1 mL,梯度脫水15 min。然后用100%乙醇1 mL脫水2次,每次20 min。用丙酮1 mL置換2次,每次15 min。然后對其進行浸漬、封裝和聚合。清洗過程依次進行乙酸二氧鈾染色和乙酸鉛染色10 min。最后,使用Malvern NanoSight系統檢測外泌體的顆粒大小。

1.4.2Western blotting鑒定外泌體 細胞用預冷的PBS洗滌,在RIPA緩沖液中溶解,RIPA緩沖液中添加1 mmol·L-1PMSF和蛋白酶抑制劑混合物(Bestbio),稀釋1：100。采用BCA蛋白測定試劑盒(Pierce)測定蛋白濃度。等量的蛋白樣品(20 μg)通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)。

分離,轉移到聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜。將膜在TBST的脫脂干奶中封閉2 h,在≤4 ℃抗體孵育過夜:CD9(1：1000)、 HSP70(1：1000)、β-catenin(1：5000)。另一種膜不加抗體TBST溶液孵育作為陰性對照。反復洗滌后,將膜與二抗結合。用TBST再次沖洗膜3次,并使用增強的化學發光襯底。使用圖像分析軟件測量各波段灰度值進行分析。

1.5外泌體的miRNA的分析與驗證 外泌體的miRNA的測序借助研載生物技術(上海)有限公司平臺完成。用TRIzol試劑提取總RNA,用聚丙烯酰胺凝膠電泳富集18 ～ 30 nt的RNA分子。然后,富集36～44 nt RNAs,用PCR提取試劑盒純化cDNA片段,形成cDNA文庫。結扎產物經瓊脂糖凝膠電泳篩選,PCR擴增,文庫借助上海研載生物技術有限公司的HiSeq 4000 (Illumina)機器進行深度測序。差異miRNAs篩選條件為|log2FoldChange|≥0.58和P<0.05。差異miRNAs的潛在靶基因由miRNA DA預測,并基于數據庫(DAVID)、GO網站 (http://www.geneontology.org/)和KEGG網站(http://www.genome.jp/kegg/)。利用熱圖對歸一化聚類數據進行轉換,繪制熱圖。

1.6采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)進行差異miRNAs驗證 分別從MHCC97H細胞組和蒼耳亭共培養的MHCC97H細胞組中提取外泌體的總RNA,使用PrimeScript RT試劑盒(TAKARA)進行逆轉錄,采用Roche LightCycler 480 II PCR體系與SYBR Green(TAKARA)進行qRT-PCR。U6和ccel-miR-39分別作為miRNAs的內參和外參。

2 結果

2.1外泌體的確證 MHCC97H組和蒼耳亭+MHCC97H組腫瘤外泌體粒徑分別為(145.5±40.8)和(147.2±41.1)nm。透射電鏡觀察顯示外泌體呈杯狀結構,直徑在正常范圍內。Western blotting實驗顯示CD9和HSP70表達呈陽性,進一步證實純化后的囊泡為外泌體(圖1)。

A.外泌體顆粒尺寸大小;B.透射電鏡觀察外泌體形態;C.免疫印跡法檢測外泌體的陽性生物標志物CD9和HSP70。

2.2外泌體miRNA譜分析 測序結果顯示,共鑒定出已知miRNAs497個,未被命名的miRNAs 510個。基因組比對率75.21%～81.78%,已知miRNA比對率0.59%～0.65%。與對照組比較,蒼耳亭處理的MHCC97H細胞中共鑒定出78個差異miRNAs,其中36個上調miRNA,42個下調miRNA(圖2)。熱圖顯示,這些差異miRNAs能夠區分蒼耳亭共培養的MHCC97H細胞組和MHCC97H細胞組(圖3)。

圖2 蒼耳亭處理MHCC97H細胞后miRNA表達譜火山圖

紅色表示高表達;藍色表示低表達。

2.3外泌體miRNA功能分析 對差異miRNAs的靶基因進行預測,將其映射到GO數據庫中,并進行比較(圖4A)。GO數據庫主要從“生物過程”“細胞組成”和“分子功能”三方面進行了分析。“生物過程”方面,基因主要與“細胞過程”“代謝過程”和“單一的生物過程”有關。“細胞過程”方面,基因主要與“細胞成分”和“細胞器組成”有關。“分子功能”方面,基因主要與“結合”和“催化活性”有關(圖4B)。

圖4 差異miRNA靶基因和所有GO基因的分布情況

2.4KEGG信號通路富集分析 KEGG對差異miRNAs靶基因的功能進行分類,富集出前20條作用的信號通路(圖5A-B)。結果顯示前20條通路,包括“癌癥通路”“鈣離子信號通路”“PI3K-Akt信號通路”“黏連信號通路”。根據miRNA測序結果,發現510個未被命名的miRNA,其中對照組發現287個未命名miRNA,蒼耳亭治療組發現354個未命名miRNA。KEGG富集分析顯示,差異miRNAs的靶基因主要集中在“鈣離子信號通路”“PI3K-Akt信號通路”“Ras信號通路”“cAMP信號通路”和“癌癥通路”(圖5C)。

A.KEGG分析miRNA靶基因的分布圖;B.KEGG分析差異miRNA靶基因分布圖;C.KEGG富集分析差異miRNA的TOP20信號通路圖;P值越小,顏色越傾向于紅色,點越大,表示通路中的基因越多;D.qRT-PCR驗證差異miRNA表達水平;①與對照組比較,P<0.05;②與對照組比較,P<0.01。

2.5qRT-PCR驗證差異miRNA 采用qRT-PCR共驗證7個差異miRNA,結果顯示,蒼耳亭與MHCC97共培養后,外泌體的let-7f-5p、miR-192-5p、miR-197-3p和let-7b-5p表達上調,與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)(圖5D),且與外泌體miRNA譜分析結果相一致。miR-21-5p、miR-483-5p、miR-372-3p的表達水平與對照組比較差異無統計學意義。

3 討論

目前肝癌是一種難以治愈的疾病。除早期手術切除和肝移植外,尚無有效的治療方法。外泌體由多種細胞分泌,包括腫瘤細胞。研究表明腫瘤細胞可以分泌比正常細胞更多的外泌體,外泌體中的miRNAs是參與基因表達轉錄后調控的小型非編碼RNAs,可以作為致癌基因或腫瘤抑制因子[10-11]。因此,外泌體中miRNAs不僅與疾病的發生發展機制相關,還可能成為較好的腫瘤早期診斷的生物標志物[12]。研究表明,miRNA在HCC細胞和組織中異常表達與疾病的發生、發展和預后密切相關[13]。除miRNAs外,外泌體還通過靶向不同的物質(如DNAs、RNAs和蛋白質)參與HCC發病機制。

蒼耳亭具有抗腫瘤藥效,能顯著改變腫瘤細胞的外泌體miRNA。蒼耳亭是從蒼耳草中提取分離的天然倍半萜內酯,具有顯著的抗腫瘤活性。研究表明,蒼耳亭對人肝癌細胞生長的體外和體內影響,其抑瘤率高達45%。蒼耳亭通過調控Wnt/β-catenin 和EMT相關蛋白,從而抑制腫瘤侵襲轉移[5]。α-亞甲基-γ-丁內酯基團為蒼耳亭活性基團結構。它優先與JAK2的Cys243、IKK β的Cys412和Cys464相互作用,它們分別是STAT3和NF-κB信號通路的關鍵調控因子[14]。因此,蒼耳亭優先抑制激活STAT3和p65的癌細胞株的生長。本研究結果與其研究一致,即蒼耳亭作用于腫瘤細胞的外泌體改變了腫瘤細胞的miRNA,這些改變的miRNA作用的信號通路豐富,包括STAT3和NF-κB信號通路。蒼耳亭對人LO2肝細胞無明顯凋亡作用[15]。進一步研究蒼耳亭的抗腫瘤機制對該藥物的開發利用具有深遠的意義。筆者收集MHCC97H細胞上清液和蒼耳亭共培養過MHCC97H細胞上清液,提取外泌體,通過透射電鏡和Western blotting對外泌體進行鑒定,確認提取的外泌體質量。對外泌體miRNAs進行高通量測序,篩選出蒼耳亭共培養MHCC97H細胞中的差異表達的miRNAs。其中,42個下調miRNAs,36個上調miRNAs。

蒼耳亭可能通過上調let-7f-5p、let-7b-5p、miR-192-5p和miR-197-3p的表達發揮治療作用。熒光定量PCR結果顯示,蒼耳亭共培養后let-7f-5p表達上調,且與對照組比較差異有統計學意義。許多研究表明,抑癌miRNA let-7家族成員在HCC中的表達下調,抑癌miRNA let-7家族成員在HCC中的表達下調,提示let-7可能作為致癌基因參與這一過程[16-18],Let-7b可能通過上調p21抑制HCC細胞的增殖。下調血清let-7-a1基因表達可能對埃及慢性HCV患者肝癌的發生有顯著影響[19]。let-7f-5p在頭頸部癌、轉移性非小細胞肺癌中的表達下調[17,20]。蒼耳亭與MHCC97H細胞共培養后外泌體let-7f-5p表達上調,推測蒼耳亭可能通過調控let-7f-5p對HCC產生治療作用。Let-7b-5p可抑制肝癌細胞中G2/M的轉化。它還能誘導肝癌細胞凋亡,同時抑制細胞增殖、轉移和EMT進展[21]。此外,已有研究報道miR-192-5p、miR-197-3p和let-7b-5p在HCC中水平較低,并能抑制HCC的生長和轉移[22-23]。miR-192-5p作為TRIP13的上游調控因子,通過與ACTN4相互作用,AKT/mTOR信號通路誘導肝癌細胞遷移、侵襲和轉移[24]。miR-197-3p可能通過部分下調ZIK1來調控HCC細胞的生存[25]。蒼耳亭處理的MHCC97H細胞中let-7f-5p、let-7b-5p、miR-192-5p和miR-197-3p表達上調,推測蒼耳亭可能通過調控let-7f-5p、let-7b-5p、miR-192-5p和miR-197-3p對HCC產生治療作用。miRNA測序結果上傳至GEO官方網站(GSE172654)。