壯藥雙路通腦方對缺血-再灌注腦損傷大鼠神經元自噬和凋亡的影響*

梅小平,翟陽,王凱華,滕紅麗,鄭光珊,楊鵬,鄒敏

(1.廣西國際壯醫醫院醫務部,南寧 530200;2.廣西國際壯醫醫院腦病科,南寧 530200;3.廣西中醫藥大學,南寧 530200;4.廣西國際壯醫醫院科技部,南寧 530200;5.廣西國際壯醫醫院兒科,南寧 530200)

缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS)是一種具有高發病率和高死亡率的常見疾病[1]。目前,靜脈溶栓和取栓是IS的首選治療手段[2]。然而,血流恢復后,往往導致缺血-再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)損傷,進一步加重腦損傷,目前仍無有效的治療方法。神經保護作用是指抑制神經元凋亡以挽救缺血半影區神經功能。因此,開發能夠抑制缺血半影區神經元凋亡的治療劑已成為該領域的一項重要任務。細胞凋亡和自噬是維持細胞穩態的兩個重要細胞過程。自噬是真核細胞用于降解長壽蛋白質和受損細胞器的主要調節分解代謝機制,介導細胞存活和凋亡[3-4]。現代研究表明細胞凋亡[5-6]是IS的重要病理特征之一,IS引起的腦I/R損傷病理機制(如神經元凋亡)與自噬有關[7],自噬對IS具有雙向作用,通過調節自噬可抑制神經元凋亡減輕腦損傷[4]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated kinase,AMPK)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target rapamycin,mTOR)信號通路可調節腦I/R后的自噬激活,是一種通過調節自噬來治療腦I/R損傷的新型治療靶點。研究顯示,AMPK/mTOR可通過Unc-51樣激酶1(UNC-51-like Kinase 1,ULK1)的磷酸化調節腦I/R誘導的自噬[8-9]。雙路通腦方由廣西特色壯藥(如扶芳藤、黃花倒水蓮、田七、茯苓等)配伍而成,治療IS療效顯著,能改善患者的神經功能,提高生活質量[10]。雙路通腦方在腦缺血損傷中發揮神經保護作用的證據以及其對IS的改善作用是否與AMPK/mTOR信號通路介導的自噬有關尚不完全清楚。因此,本研究基于AMPK/mTOR信號通路探討壯藥雙路通腦方對腦I/R誘導的神經元自噬和凋亡的影響,以期為雙路通腦方在IS等腦部疾病中的應用提供進一步的證據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠108只,體質量250～300 g,購自中國科學院上海藥物研究所,實驗動物生產許可證號:SCXK(滬)2020-0005。所有大鼠均保持在相對濕度(50%～70%)和溫度(25±2)℃的環境中,明暗循環為12 h：12 h。術前所有大鼠禁食12 h。

1.2藥物與試劑 雙路通腦方組成:扶芳藤20 g、黃花倒水蓮15 g、田七15 g、茯苓15 g、法半夏20 g、蒼術15 g、桂枝尖15 g、南山楂20 g、肉蓯蓉15 g、陳皮15 g、生姜15 g、火麻仁15 g、炙甘草5 g,以上中藥飲片來源于廣西國際壯醫醫院,批號依次為20210101,20200601,20200901,20210102,20201102,20201201,20200602,20200901,20200701,20210101,20210401,20210101和20201201,并經廣西國際壯醫醫院藥學部黃琳蕓副主任中藥師鑒定均為正品。按常規方法煎煮、過濾,并濃縮至每毫升含原藥材2 g。AMPK激活劑阿卡地新(acadesine,AICAR)(美國MedChemExpress公司,批號:HY-13417,含量:99.71%);2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色液(北京Solarbio公司,批號:G3005,含量:2%);蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(批號:C0105S)、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(批號:C1086,綠色熒光)、DAPI染色液(批號:C1006)均購自上海碧云天生物技術有限公司;兔源一抗LC3B(批號:ab48394)、Beclin-1(批號:ab207612)、p62(批號:ab155686)購自英國Abcam公司;微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC-3)A/B(#4108)、AMPK(#5831)、p-AMPK(#2535)、mTOR(#2972)、p-mTOR(#5536)、ULK1(#8054)、p-ULK1(Ser757,#14202)、p-ULK1(Ser317,#37762)和山羊抗兔IgG二抗(#14708)購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3儀器 BX61電動顯微鏡(日本Olympus公司);Hitachi H-7650透射電子掃描顯微鏡(日本日立公司);TCS SP5共聚焦激光掃描顯微鏡(德國Leica公司)。

1.4實驗分組、給藥與造模 采用隨機數字表法將SD大鼠分為假手術組、模型對照組和小、中、大劑量雙路通腦方組及大劑量雙路通腦方+AICAR組,每組18只。采用線栓法制備大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型[11]。首先,腹腔注射戊巴比妥鈉溶液3 mL·kg-1對大鼠進行麻醉。然后,在頸部右側做一個2 cm的縱向切口,分離并暴露右側頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈。結扎頸總動脈近心端和頸內動脈,于頸外動脈遠心端剪一“V”形小切口。將線栓通過此切口插入頸內動脈,然后輕輕朝向Willis環推進18～22 mm,遇到阻力后停止。缺血2 h后緩慢拉出線栓以允許再灌注。假手術組不插線栓,僅分離血管。手術期間使用溫度調節的加熱墊將直腸溫度控制在(37±0.5) ℃。待大鼠清醒后,采用5級評分法對其神經功能缺損程度進行評分,評分為1～3分的大鼠納入研究。

MCAO術前,小、中、大劑量雙路通腦方組和大劑量雙路通腦方+AICAR組灌胃給予相應劑量雙路通腦方煎液,每天1次,連續7 d。假手術組及模型對照組給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃;大劑量雙路通腦方+AICAR組在造模前60 min腹腔注射AICAR 50 mg·kg-1[12]。劑量換算:根據人和動物的體表面積計算藥物的等效劑量(大鼠的日劑量相當于成人的6.3倍)。成人平均體質量按70 kg計,成人每日雙路通腦方的給藥劑量相當于生藥200 g,換算成大鼠的日給藥劑量為200 g/70 kg×6.3=18.0 g·kg-1,因此設置9.0,18.0,36.0 g·kg-1為小、中、大劑量。

1.5神經功能缺損評分 在大鼠清醒后和MCAO術后24 h,一名對整個實驗不知情的研究人員評估大鼠神經功能缺損的程度。采用5級評分法進行神經功能缺損評估[13]。0分:沒有明顯的神經功能缺損;1分:對側前爪未完全伸直;2分:向對面盤旋;3分:跌倒對側;4分:無法行走。

1.6TTC染色檢測腦梗死體積 MCAO術后24 h評估梗死體積。每組按照隨機數字表法選取大鼠6只,取出腦組織并在-20 ℃下冷凍30 min,然后切成2 mm厚的冠狀切片,并在2% TTC中于37 ℃下孵育30 min。每個切片在4%多聚甲醛中浸泡24 h,然后攝像。Image J軟件用于分析梗死區域,計算梗死率。梗死率(%)=梗死腦組織(白色)體積/對側大腦半球體積×100%。

1.7HE染色觀察神經元形態學變化 每組按照隨機數字表法隨機選取大鼠6只,取腦組織并將其冠狀切分為兩部分,一部分將海馬CA1區切成1 mm×1 mm×1 mm的小塊,并在4 ℃下固定在2.5%戊二醛中;另一部分用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切成5 μm厚的切片,并將切片放置在載玻片上進行HE染色。光學顯微鏡下觀察缺血半影區海馬CA1區神經元形態學變化。

1.8TUNEL染色檢測神經元凋亡 取腦組織石蠟切片,經脫蠟、水化后將切片用蛋白酶K溶液(20 μg·mL-1)在37 ℃下透化30 min,然后用3%過氧化氫(H2O2)溶液滅活內源性過氧化物酶10 min。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后,將末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)和熒光素添加到切片中,并在37 ℃下避光孵育2 h。隨后,用DAPI將細胞核染色?？篃晒獯銣鐒┓馄?用熒光顯微鏡觀察切片并拍攝圖像。Image-Pro Plus 6.0版軟件用于量化TUNEL陽性神經元的數量,計算凋亡指數(apoptosis index,AI)。AI(%)=TUNEL陽性細胞數/細胞總數×100%。

1.9透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察自噬小體的形成 將固定在2.5%戊二醛中腦組織塊用PBS洗滌后,在4 ℃下浸入1%四氧化鋨中2 h。然后,將組織塊在分級乙醇溶液中脫水并包埋在環氧樹脂中,然后將塊切成超薄切片(厚度60～70 nm),用檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾染色后,使用TEM觀察自噬小體的形成情況。

1.10免疫熒光(immunofluorescence,IF)染色檢測LC3-Ⅱ的表達 將腦組織切片(厚度5 μm)脫蠟、水化后進行抗原修復。然后,用3% H2O2孵育10 min滅活,以內源性過氧化物酶,5%牛血清白蛋白封閉后,與兔源LC3B一抗(1：200)在4 ℃下孵育過夜。用PBS沖洗后,切片與山羊抗兔IgG(H+L)熒光二抗(1：200)在室溫下孵育2 h。細胞核用DAPI染色。用抗熒光淬滅劑封固后,在熒光顯微鏡下觀察海馬神經元中LC3-Ⅱ的陽性表達,并計算LC3-Ⅱ陽性表達的平均熒光強度(mean fluorescent intensity,MFI)。

1.11Western blotting檢測自噬標志基因Beclin-1、LC3A/B、p62及AMPK/mTOR信號通路相關蛋白的表達 每組剩余大鼠6只,取腦后分離海馬組織,在冰冷的RIPA裂解液中裂解10 min,12 000×g離心15 min。通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropho-resis,SDS-PAGE)分離等量的總蛋白。之后,將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯膜。在室溫下將膜在5%脫脂牛奶中封閉1 h,然后與一抗LC3A/B(1：1000)、Beclin-1(1：2000)、p62(1：1000)、AMPK(1：1000)、p-AMPK(1：500)、mTOR(1：1000)、p-mTOR(1：500)、ULK1(1：1000)、p-ULK1(S757)(1：1000)、p-ULK1(S317)(1：1000)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)(1：2000)在4 ℃下孵育過夜。然后,將膜與辣根過氧化物酶綴合的山羊抗兔IgG二抗(1：3000)在室溫下孵育1 h。增強型化學發光劑顯影后,使用Image J軟件測量目標蛋白的灰度值。GAPDH用作上樣對照。

2 結果

2.1大鼠神經功能缺損評分 與假手術組神經功能缺損評分0分比較,模型對照組神經功能缺損評分(2.89±0.30)顯著升高(P<0.05);與模型對照組比較,小、中、大劑量雙路通腦方組神經功能缺損評分分別為(2.46±0.27),(2.01±0.22),(1.50±0.18),均顯著降低(均P<0.05),且呈劑量依賴性;與大劑量雙路通腦方組比較,大劑量雙路通腦方+AICAR組神經功能缺損評分為(2.62±0.29),顯著升高(P<0.05)。

2.2大鼠腦梗死體積的影響 與假手術組梗死體積比為0%比較,模型對照組腦梗死體積(32.16±2.57)%,顯著升高(P<0.05);與模型對照組比較,小、中、大劑量雙路通腦方組腦梗死體積分別為(24.58±2.39)%,(17.43±2.12)%,(9.81±1.45)%,均顯著降低(均P<0.05),且呈劑量依賴性;與大劑量雙路通腦方組比較,大劑量雙路通腦方+AICAR組腦梗死體積(28.50±2.36)%,顯著升高(P<0.05)。見圖1。

A:假手術組;B:模型對照組;C:小劑量雙路通腦方組;D:中劑量雙路通腦方組;E:大劑量雙路通腦方組;F:大劑量雙路通腦方+AICAR組。

2.3大鼠神經元病理損傷的影響 HE染色結果顯示,假手術組缺血半影區海馬CA1區神經元形態規則,排列整齊,細胞核完整;模型對照組缺血半影區海馬神經元結構紊亂,細胞膜破壞,細胞形態腫脹,大量神經元丟失死亡,核部分溶解固縮;與模型對照組比較,小、中、大劑量雙路通腦方組缺血半影區神經元形態較規則,有少數神經元退化壞死,核固縮、細胞膜和細胞結構破壞得到明顯改善;且大劑量雙路通腦方組對神經元損傷的改善程度優于中、小劑量雙路通腦方組;大劑量雙路通腦方+AICAR組神經元損傷較大劑量雙路通腦方組明顯加重,神經元數量減少,壞死神經元增多。見圖2。

A:假手術組;B:模型對照組;C:小劑量雙路通腦方組;D:中劑量雙路通腦方組;E:大劑量雙路通腦方組;F:大劑量雙路通腦方+AICAR組。

2.4大鼠神經元凋亡的影響 與假手術組比較,模型對照組缺血半影區海馬CA1區神經元凋亡率顯著升高(P<0.05);與模型對照組比較,小、中、大劑量雙路通腦方組神經元凋亡率顯著降低(P<0.05),且呈劑量依賴性;與大劑量雙路通腦方組比較,大劑量雙路通腦方+AICAR組神經元凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖2,表1。

表1 6組大鼠神經元凋亡率和自噬小體數量比較

2.5大鼠缺血半影區海馬CA1區神經元自噬小體形成的影響 假手術組神經元正常,具有完整的細胞核、線粒體、溶酶體和內質網;模型對照組神經元可以發現許多溶酶體和自噬體,細胞形態受到嚴重影響,神經元空泡化,線粒體明顯腫脹,嵴部分斷裂;與假手術組比較,模型對照組自噬小體數量顯著增加(P<0.05);與模型對照組比較,小、中、大劑量雙路通腦方組自噬小體數量顯著減少(P<0.05),且呈劑量依賴性;與大劑量雙路通腦方組比較,大劑量雙路通腦方+AICAR組神經元自噬小體數量顯著增加(P<0.05)。見圖2,表1。

2.6大鼠缺血半影區海馬CA1區LC3-Ⅱ陽性表達的影響 與假手術組缺血半影區海馬CA1區LC3-Ⅱ陽性表達(0.031±0.004)比較,模型對照組陽性表達(0.084±0.009)顯著升高(P<0.05);與模型對照組比較,小、中、大劑量雙路通腦方組LC3-Ⅱ陽性表達分別為(0.070±0.008),(0.057±0.006),(0.044±0.005),均顯著降低(均P<0.05),且呈劑量依賴性;與大劑量雙路通腦方組比較,大劑量雙路通腦方+AICAR組LC3-Ⅱ陽性表達為(0.075±0.008),顯著升高(P<0.05)。見圖3。

A:假手術組;B:模型對照組;C:小劑量雙路通腦方組;D:中劑量雙路通腦方組;E:大劑量雙路通腦方組;F:大劑量雙路通腦方+AICAR組。

2.7大鼠海馬組織LC3、Beclin-1、p62蛋白表達的影響 與假手術組比較,模型對照組LC3-II/LC3-I比值和Beclin-1蛋白水平顯著升高,p62蛋白水平顯著降低(P<0.05);與模型對照組比較,小、中、大劑量雙路通腦方組LC3-II/LC3-I比值和Beclin-1蛋白水平顯著降低,p62蛋白水平顯著升高(P<0.05),且呈劑量依賴性;與大劑量雙路通腦方組比較,大劑量雙路通腦方+AICAR組LC3-II/LC3-I比值和Beclin-1蛋白水平顯著升高,p62蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見圖4,表2。

表2 6組大鼠海馬組織LC3、Beclin-1、p62蛋白表達比較

A:假手術組;B:模型對照組;C:小劑量雙路通腦方組;D:中劑量雙路通腦方組;E:大劑量雙路通腦方組;F:大劑量雙路通腦方+AICAR組。

2.8大鼠海馬組織AMPK/mTOR信號通路相關蛋白表達的影響 與假手術組比較,模型對照組的p-AMPK/AMPK和p-ULK1(S317)/ULK1比值顯著升高,p-mTOR/mTOR和p-ULK1(S757)/ULK1比值顯著降低(P<0.05);與模型對照組比較,小、中、大劑量雙路通腦方組p-AMPK/AMPK和p-ULK1(S317)/ULK1比值顯著降低,p-mTOR/mTOR和p-ULK1(S757)/ULK1比值顯著升高(P<0.05),且呈劑量依賴性;與大劑量雙路通腦方組比較,大劑量雙路通腦方+AICAR組p-AMPK/AMPK和p-ULK1(S317)/ULK1比值顯著升高,p-mTOR/mTOR和p-ULK1(S757)/ULK1比值顯著降低(P<0.05)。見圖5,表3。

表3 6組大鼠海馬組織AMPK/mTOR信號通路相關蛋白表達比較

A:假手術組;B:模型對照組;C:小劑量雙路通腦方組;D:中劑量雙路通腦方組;E:大劑量雙路通腦方組;F:大劑量雙路通腦方+AICAR組。

3 討論

在我國,中藥已廣泛用于預防或治療腦缺血或IS及其并發癥,如補陽還五湯[11]、安宮牛黃丸、銀杏葉等[14]。壯醫是祖國傳統醫學的重要組成部分,在IS中有其獨特的生理病理觀和治療原則。壯醫將大腦稱為“巧塢”,人的神智、思維和認知行為均屬于“巧塢”的功能。壯醫認為“三道兩路”(氣道、水道、谷道、龍路、火路)是人體內部氣血化生和運行的關鍵。IS的病因毒邪經“三道兩路”侵入人體臟腑組織,加之外感毒邪,“三道兩路”運行不暢,氣血運行失常,臟腑失去濡養,痰瘀阻滯,濕熱內生,引發“巧塢崩”。因此,通調“三道兩路”提升臟腑功能是IS的重要治療原則[15-16]。雙路通腦方中扶芳藤、黃花倒水蓮和田七均是廣西特色壯藥,具有通火路、龍路、祛濕解毒、活血化瘀的功效。茯苓善滲泄水濕,使濕無處聚,痰無由生;蒼術能健運脾胃、祛除寒濕;法半夏、陳皮有燥濕化痰、理氣健脾的作用。提示雙路通腦方具有祛除體內毒邪,疏通龍路、火路,使“三道兩路”恢復平衡的作用。

研究證實,雙路通腦方對IS療效確切[10]。在本研究中,雙路通腦方以劑量依賴性方式改善MCAO大鼠的神經功能,并減少腦梗死體積和神經元凋亡。提示雙路通腦方對IS具有神經保護作用,這與以往的研究結果一致。此外,雙路通腦方減少了海馬CA1區自噬小體的形成,抑制LC3-II/LC3-I比值的增加,并增加缺血半影區海馬中p62水平,下調了Beclin-1表達;表明雙路通腦方的神經保護作用與抑制自噬有關。本研究結果也與之前的其他研究一致[8-9],這表明抑制自噬可改善再灌注24 h后的缺血性腦損傷。然而,SUN等[17]報道,自噬的誘導可防止再灌注24 h后的腦I/R損傷。適當的自噬對缺血性神經組織具有保護作用,而過度的自噬可能導致細胞死亡。自噬在IS中的作用存在爭議,可能是由于不同的動物品系、缺血模型和缺血時間以及評估自噬的治療時間窗的差異造成的。此外,WANG等[18]提出自噬對IS有益還是有害取決于自噬的程度和持續時間。本研究表明,自噬對IS有害,雙路通腦方預處理介導的自噬抑制可進一步減少梗死體積并改善神經功能缺損。因此,IS的潛在治療策略是優化自噬水平,而雙路通腦方可能有助于實現這一目標。

AMPK/mTOR信號通路可以通過ULK1的協同磷酸化來調節腦I/R后的自噬激活。AMPK是哺乳動物細胞中mTOR的上游調節因子,AMPK促進自噬,mTOR抑制自噬[19]。AMPK通過Ser317的磷酸化直接激活自噬起始激酶ULK1來促進自噬。高mTOR活性通過磷酸化ULK1 Ser757并破壞ULK1和AMPK之間的相互作用來防止ULK1活化[20]。活化的AMPK可以抑制mTOR激活以減少ULK1在Ser757上的磷酸化。本研究發現,在MCAO術后,p-AMPK和p-ULK1 Ser317水平上調,而p-mTOR和p-ULK1 Ser757水平下調;這些結果與黃亞光等[8]研究結果一致。表明AMPK的活化抑制mTOR減少S757-ULK1磷酸化,然后磷酸化S317-ULK1,在腦I/R損傷期間誘導自噬。雙路通腦方顯著降低了p-AMPK和p-ULK1 Ser317的水平,同時增加了p-mTOR和p-ULK1 Ser757的水平。在給予AICAR激活AMPK后,自噬水平增加,雙路通腦方的神經保護作用和對AMPK/mTOR信號通路的調節作用被明顯減弱。提示雙路通腦方可能通過調節AMPK/mTOR信號通路抑制神經元的過度自噬。

綜上所述,雙路通腦方可抑制腦I/R誘導的自噬和神經元凋亡,其作用機制可能涉及抑制AMPK和ULK1在S317處的磷酸化,以及增強mTOR和ULK1在Ser757處的磷酸化。本研究以腦I/R誘導的自噬和神經元凋亡為病理基礎,在免疫組織學上對自噬和凋亡進行了分析,以自噬為研究重點,采用TUNEL染色檢測神經元凋亡來驗證雙路通腦方調節自噬改善腦損傷的結果,今后將增加凋亡相關蛋白表達的檢測,進一步對神經元凋亡進行驗證。此外,在給予AICAR激活AMPK后,與單獨應用大劑量雙路通腦方組相比,大鼠腦組織自噬水平增加,雙路通腦方的神經保護作用和對AMPK/mTOR信號通路的調節作用被明顯減弱,提示雙路通腦方可能是通過調節AMPK/mTOR信號通路發揮作用。為減少實驗動物用量,降低實驗成本,符合動物實驗的3R原則,故未進行模型對照組+AICAR組相關研究,在后續的研究中將繼續對小、中劑量雙路通腦方+AICAR組進行研究,驗證實驗結果是否呈劑量依賴性,來進一步增強實驗結果的準確性和可靠性。同時尚不清楚雙路通腦方是否還調節其他途徑以及其在不同缺血時間中對自噬是否發揮相同作用,還待進一步研究。