生育后期干旱脅迫對玉米碳氮分配及生理特征的影響

孫煥烜,尚宏越,郭銀銀,張 佩,董志強,李亞君

(西北農林科技大學 農學院,陜西楊凌 712100)

碳、氮代謝是作物最基本的兩大代謝過程,二者相互影響,協調統一[1]。以光合作用為核心的碳代謝為作物生長發育提供最基本的結構和能量來源,也為氨基酸等含氮化合物合成提供物質基礎。氮代謝為碳代謝提供酶和光合色素,作物氮素營養狀況是影響碳同化效率的重要因素[2-3]。干旱脅迫會引起農作物碳、氮代謝失衡[4]。在營養生長階段,干旱脅迫下光合速率下降,碳水化合物供應不足,氮素吸收受限,作物生長發育不良[5]。在生育后期,干旱脅迫可能會導致植株早衰、籽粒早熟,碳、氮同化物在源庫間的轉運和分配發生改變[6]。

作物生育后期自然衰老過程中伴隨著養分由營養器官向生殖器官的轉移和重新分配,這是其高效利用養分的重要生存策略之一[7]。干旱脅迫會改變這一進程,而碳、氮代謝等相關途徑參與其中多方面的調控作用[2,4]。在生理水平上,干旱脅迫下光合機能下降,營養器官碳水化合物合成受阻,過剩的光能可能導致活性氧的大量積累,加速衰老進程,導致植株不能維持正常的形態及生理功能[8]。氮素養分狀況是影響植株衰老的重要因素之一,營養器官較高的氮素水平有利于干旱脅迫下光合機能的維持,延緩衰老,提高耐旱性[9-10]。在代謝水平上,一些碳、氮代謝產物,如可溶性糖、糖醇類、脯氨酸、谷胱甘肽、多胺等是干旱脅迫下重要的滲透調節物質、抗氧化物質和信號分子等,參與作物抵御干旱脅迫的多種適應途徑[8,11-12]。

植物碳代謝過程中,光合產物以蔗糖的形式輸出并轉運,其后在庫器官中轉化為淀粉等儲存,蔗糖和淀粉相互轉化受碳代謝關鍵酶的調節[13]。其中蔗糖合成酶主要參與催化將蔗糖轉化為UDPG和果糖,可溶性淀粉合成酶則主要參與支鏈淀粉的合成[14-15]。谷氨酰胺合成酶是谷氨酰胺合成的關鍵酶,在植物氮素吸收及同化過程中具有重要作用。在植物生育后期,谷氨酰胺是營養器官向生殖器官氮素轉運的重要載體,因而谷氨酰胺合成酶也是生育后期氮素轉運的關鍵[2]。

生育后期干旱脅迫會嚴重影響玉米籽粒發育,導致產量下降[16]。目前,盡管已有部分研究對干旱脅迫下玉米碳、氮同化物積累及分配特征進行了探討,但對于其生理及代謝調節機制仍較少報道。基于此,本研究從碳、氮同化物分配角度出發,通過測定碳、氮代謝關鍵酶活性及轉錄組測序分析,探討干旱脅迫對玉米生育后期物質代謝的影響特征。為解析干旱脅迫下的代謝調節機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗在陜西省楊凌示范區西北農林科技大學防雨棚中池栽進行,棚中設2 m×1.5 m的水泥池小區,各池間筑水泥墻防止測滲。池內土壤為婁土,除水分處理外,池栽玉米各項栽培措施與常規田間管理一致。所用玉米品種為‘鄭單958’,吐絲期以前所有處理均充分供水,吐絲期以后,使用TDR法監測并控制土壤供水量,對照為正常供水處理(Well watered,WW) ,保持土壤相對含水量在75%以上。干旱脅迫處理(Drought stress,DS) 土壤相對含水量為45%～55%至取樣,每處理3個重復小區。

1.2 項目測定方法

1.2.1 生物量,碳、氮同化物含量及分配 分別于玉米成熟期取整株地上部分(不包括雄穗),按葉片、莖稈、穗軸和籽粒分開,烘干用測定各部位(莖稈、葉片、穗軸、苞葉、籽粒等)生物量、可溶性糖、蔗糖、淀粉、全氮等碳、氮同化物含量。其中生物量為各部位干質量,可溶性糖、蔗糖、淀粉含量的測定參照高俊鳳的方法[17],氮含量(全氮)的測定使用凱氏定氮法[18]。相關參數計算如下:

各部位(莖稈、葉片、穗軸、苞葉、籽粒)碳、氮同化物積累量 = 干質量×碳、氮同化物含量

碳、氮同化物分配比例(%) =(碳、氮同化物積累量/地上部分總積累量)× 100%

1.2.2 碳氮代謝關鍵酶活性 生育后期(吐絲后50 d)分別取葉片(取樣部位為穗位葉)和籽粒鮮樣。用于測定碳氮代謝關鍵酶活性及基因表達分析。其中蔗糖合成酶(sucrose synthase,SS)活性(合成方向活性)的測定使用UDPG反應法進行[17]。可溶性淀粉合成酶(soluble starch synthase,SSS) 和谷氨酰胺合成酶(GS) 活性的測定參照Zhang等[19]的測定方法進行。

1.2.3 葉片轉錄組測序分析 對干旱脅迫(DS)與對照(WW)葉片進行轉錄組測序,分析干旱脅迫對生育后期葉片差異基因表達的影響。方法如下:分別取干旱脅迫(DS)和對照(WW)玉米葉片鮮樣用于RNA提取和cDNA文庫制備。總RNA的提取使用TRIzol試劑完成,使用DNase Ⅰ消化基因組DNA,純化后的RNA用于構建cDNA文庫,每處理3重復。構建好的cDNA文庫使用Illumina平臺進行轉錄組測序,經測序獲得的高質量序列與玉米參考基因組比對并進行基因差異基因篩選及分析,其中|log2fold-change(FC)|≥1且false discovery rate <0.05判定為差異基因。對差異表達基因的代謝途徑分析使用Mapman完成[20]。

1.3 數據分析

數據統計分析使用R軟件(Version 3.6.1)完成,數據顯著性檢驗采用單因素方差分析(ANOVA)法完成。圖表的制作使用Microsoft office 2013完成。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫下成熟期各部分生物量及碳氮同化物分配狀況

如圖1所示,生育后期干旱脅迫處理顯著降低了成熟期地上各部分生物量積累,其中整株生物量和穗粒質量分別降低28.3%和32.5%,可見干旱脅迫顯著抑制了產量的形成,對穗軸和苞葉生物量的影響較小。在碳水化合物含量方面(表1),干旱脅迫下玉米莖稈、葉片、穗軸中可溶性糖含量與正常供水處理相比均顯著降低,降低幅度分別為21.5%、10.7%、7.3%,籽粒可溶性糖含量在兩處理間無顯著差異。干旱脅迫下莖稈、葉片蔗糖含量分別顯著降低29.8%、18.6%。干旱脅迫顯著降低了成熟期籽粒淀粉含量,幅度為 2.6%,而莖稈和葉片中淀粉含量則分別增加41%和26.3%。在氮含量方面,干旱脅迫下玉米葉片和籽粒氮含量分別降低29.7%和4%,而穗軸中氮含量則顯著增加。

表1 兩種水分處理下玉米不同部位碳、氮同化物的含量Table 1 Carbohydrate,nitrogen content among different parts under two water treatments

不同小寫字母表示兩種水分處理在P<0.05水平下差異顯著,下同

表2給出了生育后期干旱脅迫對成熟期各部分生物量及碳、氮同化物分配比例的影響。干旱脅迫下生物量在各部位的分配比例顯著改變,表現為生物量在莖稈中的分配比例升高3.1%,而在籽粒中的分配比例則下降6.1%,可見干旱脅迫降低了玉米籽粒生物量分配比例(收獲指數)。在碳水化合物分配方面,干旱脅迫對玉米莖稈、葉片中可溶性糖分配無明顯影響,籽粒可溶性糖分配比例下降4.0%,穗軸和苞葉中的分配比例則分別提高2.5%和0.8%。干旱脅迫下莖稈、葉片蔗糖分配比例在處理間無顯著差異。成熟期淀粉大量分配于籽粒中,干旱脅迫下籽粒淀粉分配比例有所下降,而莖稈和葉片中的分配比例則分別增加0.67%和0.36%。在氮素分配方面。干旱脅迫下葉片氮素分配比例下降3%,籽粒氮分配比例(氮收獲指數)下降2.7%,而莖稈、穗軸中氮素分配比例則顯著增加。可見干旱脅迫下生育后期氮素由營養器官向籽粒的分配受到了抑制,更多的氮素分配于莖稈等部位。

表2 兩種水分處理下不同部位生物量及碳、氮同化物分配的比例Table 2 Biomass,carbohydrate,nitrogen distribution rate among different parts under two water treatments

2.2 干旱脅迫下碳氮代謝關鍵酶活性

對生育后期(吐絲后50 d)不同部位碳、氮代謝關鍵酶活性進行測定,結果如圖2所示。干旱脅迫與對照相比葉片及籽粒中蔗糖合成酶活性均無明顯差異。干旱脅迫下葉片可溶性淀粉合成酶活性顯著高于正常供水處理,而籽粒中則顯著降低。干旱脅迫處理顯著提高吐絲后50 d葉片谷氨酰胺合成酶(GS)活性,兩種水分處理對籽粒中的GS活性影響較小。

圖2 兩種水分處理對生育后期葉片和籽粒中蔗糖合成酶、可溶性淀粉合成酶和谷氨酰胺合成酶活性的影響Fig.2 SS,SSS and GS activity in leaves and grains at later growth stage under two water treatments

2.3 干旱脅迫對玉米葉片差異基因表達分析

比較干旱脅迫與對照葉片的轉錄組基因表達譜差異,篩選差異表達基因(DEGs)并進行代謝途徑分析,結果表明:與對照(CK)相比,干旱脅迫下共檢測到51個DEGs,其中上調表達28個,下調表達22個(圖3-A)。對上述DEGs的代謝途徑分析結果表明,部分差異基因分布在一些碳、氮及相關代謝途徑(圖3-B),例如細胞壁組織(Cell wall organisation)、碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)、光合作用(Photosynthesis)、氨基酸代謝(Amino acid metabolism)、蛋白質合成(Protein biosynthesis)等。

圖3 干旱脅迫下差異基因統計(A)及代謝途徑分析(B)Fig.3 Statistics of DEGs(A) and metabolic pathway classification(B)under drought stress

對上述途徑中與碳、氮代謝相關的部分DEGs進行了進一步分析,相關DEGs信息見表3。在細胞壁組織代謝途徑中的6個DEGs在干旱脅迫下均顯著下調表達,這些DEGs主要包括纖維素合成酶基因(zm00001d043477、zm00001d032776),木質素漆酶(zm00001d042905、 zm00001d012408)等。碳水化合物代謝途徑中編碼磷酸甘露糖異構酶(zm00001d040020)基因在干旱脅迫下顯著上調表達,己糖激酶基因(hexokinase)顯著下調表達。光合作用途徑的兩個DEGs中上調表達的基因為編碼NAD(P)H醌氧化還原酶基因(zm00001d019605),下調表達的基因為編碼絲氨酸乙醛酸氨基轉移酶基因(zm00001d031403)。蛋白質合成途徑中30S 核糖體蛋白基因(zm00001d053713)表達量顯著降低。總體而言,干旱脅迫對上述代謝途徑基因表達主要呈抑制趨勢。

表3 干旱脅迫下部分碳、氮代謝相關途徑差異表達基因詳情Table 3 Information of DEGs for carbohydrates and nitrogen related metabolic pathways in maize leaves under DS treatment

3 討 論

本研究中,生育后期干旱顯著降低玉米粒質量和生物量積累,且生物量在營養器官(莖稈、葉片等)中的分配比例增加,而籽粒中的分配比例(收獲指數)則顯著下降(圖1),這與前人的研究結果一致[21]。干旱脅迫下玉米葉片種的可溶性糖含量及分配比例降低,籽粒淀粉含量降低,這與干旱脅迫下光合機能的下降有關[14]。在氮代謝方面,干旱脅迫下葉片氮素含量及分配比例均顯著降低,這可能與干旱脅迫下葉片早衰導致的氮素流失有關[6]。干旱脅迫下籽粒氮收獲指數顯著降低,而莖稈中分配則顯著增加。類似的結果前人的研究中也有報道,籽粒是玉米生育后期最大的氮匯,干旱脅迫顯著限制了籽粒生長,導致籽粒氮素庫容量顯著降低,從而使得更多的氮素停留在莖稈等部位[22]。可見干旱脅迫對生育后期碳、氮同化物向籽粒的分配總體呈抑制作用,而使其更多地分布于營養器官中[23]。

在碳、氮代謝關鍵酶活性方面,干旱脅迫下葉片可溶性淀粉合成酶活性增加,可溶性糖含量降低,而淀粉含量顯著增加,可見干旱脅迫促進葉片中可溶性糖向淀粉的轉化。這與Abdelgawad等[14]的研究結果一致,即干旱脅迫可能會促進營養器官淀粉的生物合成,而較高的淀粉含量更有利于維持脅迫條件下的葉片生長及碳水化合物供應,緩解氧化傷害。與葉片中不同,籽粒可溶性淀粉合成酶活性在干旱脅迫下顯著降低,這與籽粒淀粉含量及分配比例均下降的結果一致[15]。吐絲后50 d,干旱脅迫下葉片GS活力顯著提高,這有助于清除逆境脅迫下產生的過量氨[24]。同時,干旱脅迫下GS活力的升高加速了葉片氮素轉運,這與本研究中干旱脅迫下葉片氮含量及分配比例均顯著降低的結果一致,類似的趨勢在其他研究中也有報道[25]。

轉錄組測序結果表明(表3),在細胞壁組織代謝途徑中,纖維素合成酶基因在干旱脅迫下均顯著下調表達,其原因可能與干旱脅迫下碳水化合物供應受阻,纖維素合成酶活性及纖維素含量降低有關[14]。木質素是細胞壁的重要組分,植物組織木質化程度的高低對維持逆境脅迫下植株固有的形態至關重要,因而顯著影響其抵御干旱等非生物脅迫的能力[26]。木質素漆酶是木質素的生物合成的關鍵[27],本研究中,干旱脅迫下兩個木質素漆酶基因均顯著下調表達,表明干旱脅迫下木質素的合成受到抑制,而纖維素、木質素等合成的抑制不利于植株維持其正常形態,從而引起植株萎蔫,加速衰老進程[28]。在光合作用代謝途徑中,編碼NAD(P)H醌氧化還原酶基因在干旱脅迫下顯著上調表達,類似的趨勢在其他研究中也有報道,其作用可能與維持干旱脅迫下的能量供應及蛋白的正常生理功能有關[29]。絲氨酸乙醛酸氨基轉移酶基因顯著下調表達,該酶主要參與光呼吸過程,隨著葉片的衰老及光呼吸的降低,其活性顯著下降[30]。在碳水化合物代謝途徑中,干旱脅迫下編碼磷酸甘露糖異構酶基因顯著上調表達,該酶參與合成干旱脅迫下重要的滲透調節物質——甘露醇。因此,該基因的上調表達可能與干旱脅迫下甘露醇的合成有關[11,31]。己糖激酶基因顯著下調表達,其與干旱脅迫下碳同化水平的降低有關[31]。

4 結 論

生育后期干旱脅迫下籽粒中可溶性糖、淀粉、氮素等的分配比例均顯著降低,而莖稈及穗軸中的分配比例則顯著增加,可見干旱脅迫不利于碳、氮同化物向籽粒分配。干旱脅迫下生育后期葉片GS活性顯著提高,籽粒SSS活性顯著降低,這與干旱脅迫下葉片氮含量及籽粒淀粉含量的降低有關。轉錄組測序結果表明,干旱脅迫對葉片細胞壁形成、碳水化合物代謝等代謝途徑基因表達總體呈抑制作用,其中對木質素等合成途徑的抑制作用可能是其引起葉片早衰的重要原因之一。