21種化學藥劑對獼猴桃黑點病菌(Diaporthe phaseolorum)的室內(nèi)毒力及田間防效

王 麗,田玉潔 ,劉 巍,黃麗麗,2, 秦虎強

(1.西北農(nóng)林科技大學 植物保護學院,陜西楊凌 712100,2.旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室,陜西楊凌 712100)

獼猴桃黑點病(Kiwifruit black spot disease)[1]俗稱獼猴桃果實黑頭病,也稱黑點病,是近年在陜西獼猴桃生產(chǎn)中新出現(xiàn)的一種重大果實病害,該病害在陜西各獼猴桃主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生,尤以‘翠香’‘徐香’品種上發(fā)生較為普遍,危害連年加重。2020年,付博等[2]首次報道認為陜西省周至等地發(fā)生的獼猴桃黑點病病原菌為間座殼屬真菌(有性態(tài))(Diaportheeres),無性態(tài)為擬莖點霉屬(Phomopsis);該病菌主要危害獼猴桃果實,也可侵染葉片和嫩枝(室內(nèi)人工接種),但田間較少見到葉片和嫩枝病癥。侵染果實表皮發(fā)病后在果實表皮上產(chǎn)生大量黑斑,可導致果實及早成熟、變軟、早落,后期果皮變黑、果實變軟、果肉腐爛、貯藏期極易腐爛變質(zhì)等[2],嚴重影響產(chǎn)量、果肉品質(zhì)和商品性,當?shù)毓r(nóng)深受其害、損失嚴重。據(jù)2018-2020年夏秋季西北農(nóng)林科技大學果樹病害病原生物學及綜合防治研究實驗室獼猴桃重點病害防探課題對眉縣、周至縣兩大獼猴桃產(chǎn)區(qū)10個鄉(xiāng)鎮(zhèn)主要栽培品種田間果實黑點病調(diào)查結果,發(fā)病品種主要為‘翠香’和‘徐香’;一般田塊病果率在10%～50%,平均病果率達到30%以上,嚴重田塊病果率達到90%以上,對獼猴桃生產(chǎn)造成巨大損失,加上缺乏防控技術,嚴重影響和阻礙了獼猴桃產(chǎn)業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展,已成為生產(chǎn)中亟待解決的突出問題。目前尚未見到有關獼猴桃黑點病發(fā)生規(guī)律及化學防治方面的研究報道。為明確其化學防治技術,采用菌絲生長速率法,測定了21種不同化學藥劑對獼猴桃黑點病菌的毒力,并選擇其中16種藥劑進行田間藥效試驗,以便篩選出對獼猴桃黑點病有效防治藥劑,明確其田間防治效果。

1 材料與方法

1.1 室內(nèi)藥劑毒力測定

1.1.1 供試菌株 獼猴桃黑點病病原菌間座殼屬真菌(Diaporthephaseolorum)由西北農(nóng)林科技大學果樹病害病原生物學及綜合防治研究團隊實驗室分離并保存。對病原菌進行活化培養(yǎng)后,將菌餅保存在甘油中,并置于-80 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)保存,備用。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基制備過程:取新鮮馬鈴薯200 g,去皮,切成大小均勻的小塊,鍋內(nèi)加入≤1 L的水,放入馬鈴薯塊煮沸至適宜程度(用玻璃棒可以輕松戳穿),用紗布將培養(yǎng)基過濾至燒杯中,并稱量20 g葡萄糖放入燒杯中,攪拌至完全溶化,加水補足1 L。稱取15～20 g瓊脂粉備用,分別放入3個500 mL三角瓶中,并將1 L培養(yǎng)基分裝于其中,每個三角瓶中加入約400 mL,包扎嚴密,121 ℃濕熱滅菌45 min,備用。

1.1.3 供試儀器及材料 儀器:RQX-380D智能人工氣候箱、101A-2ET電熱鼓風干燥箱、VS-840K-U超凈工作臺、BCD-216FTB海爾家用電冰箱、ZPS-160恒溫生化培養(yǎng)箱、SX-500高壓蒸汽滅菌器等。

材料:培養(yǎng)皿(d=8 cm)、2 mL、10 mL和50 mL離心管、100 mL和400 mL的三角瓶、玻璃棒、量杯、藥勺、試管、刻度直尺等常規(guī)試驗材料。

1.1.4 供試藥劑 18.7%丙環(huán)·嘧菌酯(丙環(huán)唑11.7%+嘧菌脂7%)懸浮劑(SC),先正達(中國)投資有限公司生產(chǎn);30%氟酰羥·苯甲唑(氟唑菌酰羥胺7.5%+苯醚甲環(huán)唑12.5%)懸浮劑(SC),先正達(中國)投資有限公司生產(chǎn);25%吡唑醚菌酯乳油(EC),巴斯夫植物保護(江蘇)有限公司生產(chǎn);43%戊唑醇懸浮劑(SC),拜耳作物科學(中國)有限公司生產(chǎn);30%苯甲·丙環(huán)唑(苯醚甲環(huán)唑15%+丙環(huán)唑15%)乳油(EC),先正達(中國)投資有限公司生產(chǎn);50%腐霉利可濕性粉劑(WP),日本住友化學株式會社生產(chǎn);30%啶 酰·咯菌腈(啶酰菌胺24%+咯菌腈6%)懸浮劑(SC)[3],陜西上格之路生物科學有限公司生產(chǎn);1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑(AS)[4],陜西省西安嘉科農(nóng)化有限公司生產(chǎn);20%烯肟·戊唑醇(戊唑醇10%+烯肟菌胺10%)懸浮劑[5],沈陽科創(chuàng)化學品有限公司生產(chǎn);10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑(WG),深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司生產(chǎn);27%寡糖·吡唑酯(氨基寡糖素2%+吡唑醚菌酯25%)水乳劑(EW),海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司生產(chǎn);20%抑霉唑水乳劑(EW),一帆生物科技有限公司生產(chǎn);24%腈苯唑懸浮劑(SC),美國陶氏益農(nóng)有限公司生產(chǎn);25%抑霉·咯菌腈(抑霉唑20%+咯菌腈5%)懸乳劑(SE),一帆生物科技集團有限公司生產(chǎn);62%嘧環(huán)·咯菌腈(咯菌腈25%+嘧菌環(huán)胺37%)水分散粒劑(WG),先正達(中國)投資有限公司生產(chǎn);40%百菌清可濕性粉劑(WP)[6],四川稼得利科技開發(fā)有限公司生產(chǎn);50%多菌靈可濕性粉劑(WP),山東華陽科技股份有限公司生產(chǎn);80%甲基托布津可濕性粉劑(WP),西安204所農(nóng)用化學品有限公司;5%氨基寡糖素水劑(AS),海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司;糖醇鈣(Ca≥180 g/L)水劑(AS),河南萃可多生物科技有限公司;硝酸氨鈣(Ca≥18%,N≥15%)可溶性粒劑(SG),天津市天力化學試劑有限公司。

1.1.5 菌株的活化與材料準備 將保存于 -80 ℃的供試菌餅轉接到PDA培養(yǎng)平板上,于 28 ℃無光照條件進行擴繁;準備培養(yǎng)皿、試管、離心管、量杯、燒杯、蒸餾水等儀器與材料,為接下來的試驗做準備。

1.1.6 藥劑濃度梯度設置及含藥培養(yǎng)基制備 藥劑濃度梯度設置見表1。根據(jù)表2預試驗設置濃度梯度稀釋藥液,各藥劑的每個質(zhì)量濃度梯度取450 μL加入裝有45 mL PDA培養(yǎng)基的三角瓶中,搖勻,平均倒入3～4個培養(yǎng)皿中(即3～4個重復),待接菌。

表1 供試藥劑及質(zhì)量濃度設置Table 1 Tested reagent and mass concentration setting

表2 21種藥劑對獼猴桃黑點病菌毒力測定結果Table 2 Toxicity test of 21 fungicides against Diaporthe phaseolorum

1.1.7 藥劑室內(nèi)毒力測定 采用殺菌劑的菌絲生長速率法[7-8]。首先取出在PDA培養(yǎng)基上轉接活化5 d后的獼猴桃黑點病菌,在無菌操作臺中用內(nèi)徑為6.0 mm的滅菌打孔器沿菌落邊緣切取菌餅,并按菌絲面朝下的方式接種于含藥平板中央,密封后放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi),連續(xù)培養(yǎng)5 d后測量各處理菌落直徑。以不含藥劑的 0.1%的吐溫80水溶液處理作空白對照,每處理做4個重復。采用十字交叉法垂直測量,求其平均值。根據(jù)4次重復的試驗結果,求出各處理濃度梯度的平均菌落生長直徑,并計算不同處理濃度對獼猴桃黑點病的菌絲生長抑制率[9]。

菌落生長直徑=各處理菌落直徑-菌餅直徑(6.0 mm)

菌絲生長抑制率=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落生長直徑]× 100%

1.2 田間藥效試驗藥劑

1.2.1 試驗地情況 試驗地點:試驗田設置在陜西省周至縣廣濟鎮(zhèn)上二屯村,土壤肥力、土質(zhì)狀況中等,近幾年‘翠香’品種黑點病發(fā)生較重,試驗園栽培管理、土壤及水肥條件均中等一致。供試獼猴桃品種為‘翠香’,植株行距約4 m,株距約 2 m,樹齡約8～10 a,長勢一般。

1.2.2 試驗處理 試驗設:①18.7%丙環(huán)·嘧菌酯SC 600 g/hm2(1 500倍);②62%嘧環(huán)·咯菌腈WG 600 g/hm2(1 500倍);③20%氟酰羥·苯甲唑SC 600 g/hm2(1 500倍);④43%戊唑醇SC 225 g/hm2(4 000倍);⑤20%抑霉唑水乳劑(EW)900 g/hm2(1 000倍);⑥25%吡唑醚菌酯EC 720 g/hm2(1 250倍);⑦50%腐霉利WP 600 g/hm2(1 500倍);⑧10%苯醚甲環(huán)唑WG 600 g/hm2(1 500倍);⑨硝酸氨鈣 (SG) 1 500 kg/hm2(土施);⑩戊唑醇(430 g/L)懸浮劑(SC)450 g/hm2(2 000倍);24%腈苯唑懸浮劑(SC)900 g/hm2(1 000倍);27%寡糖·吡唑酯水乳劑(EW)900 g/hm2(1 000倍);30%啶酰·咯菌腈懸浮劑(SC)900 g/hm2(1 000倍);1.8%辛菌胺醋酸鹽(AS)900 g/hm2(1 000倍);20%烯肟·戊唑醇懸浮劑(SC)900 g/hm2(1 000倍);5%氨基寡糖素SL(1 800 g/hm2)+糖醇鈣SL(1 800 g/hm2)(500倍);不施藥空白對照。

1.2.3 試驗方法 試驗1于2020年6月24日、7月8日共施藥兩次,8月15-17日藥效調(diào)查;試驗2于2021年7月7日、7月31日,共施藥兩次,8月15日藥效調(diào)查;每試驗處理10～15株,試驗重復3次。均使用HY-16L-B2背負式手動噴霧器,按照施藥劑量兌水噴霧,盡量使藥劑均勻全面地覆蓋在葉片正背面,藥液量為60 kg/666.7 m2。

1.2.4 試驗調(diào)查 分別于施藥前及最后一次施藥后10～15 d調(diào)查田間發(fā)病情況,每個處理小區(qū)調(diào)查5株,每株隨機調(diào)查100個果實,記錄調(diào)查病果率及病級,計算各供試藥劑處理病情指數(shù)及防效;同時,施藥后3、7 d觀察果樹對不同藥劑處理的反應及安全性。

病害病情調(diào)查分級標準:以病斑面積占整個果實表面積百分率來分級,共分6級。

0級:果實表面無病斑;1級:果實表面病斑面積≤5%;3級:果實表面病斑面積>5%,≤15%;5級:果實表面病斑面積>15%,≤30%;7級:果實表面病斑面積>30%,≤45%;9級:果實表面病斑面積>45%。病果率(%)=(病果數(shù)/調(diào)查果實數(shù))×100

病情指數(shù)=[∑(各級病果數(shù)×級值)/(最高級值9×調(diào)查總果實數(shù))]×100

防治效果=[1-(CK0× PT1)/(CK1× PT0)]×100%

式中:CK0空白對照區(qū)藥前病指; PT1處理區(qū)藥后病指; CK1空白對照區(qū)藥后病指; PT0處理區(qū)藥前病指。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用 DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)分析軟件[10],對室內(nèi)毒力測定結果各藥劑濃度梯度值及其相應的菌絲生長抑制率進行回歸分析,分別計算21種殺菌劑對獼猴桃黑點病菌菌株的EC50、相關系數(shù)、回歸方程;對田間藥效試驗結果進行方差分析,采用Duncan氏新復極差法進行多重比較和差異顯著性比較。

2 結果與分析

2.1 21種殺菌劑對獼猴桃黑點病菌室內(nèi)毒力測定結果

表2結果顯示,①供測試的21種殺菌劑中有20%烯肟·戊唑醇SC、30%啶酰·咯菌腈、43%戊唑醇SC、18.7%丙環(huán)·嘧菌酯SC、20%氟酰 羥·苯甲唑SC、27%寡糖·吡唑酯EW、30%苯甲·丙環(huán)唑EC、25%抑霉·咯菌腈SE和24%腈苯唑SC 9種藥劑對黑點病菌具有極強的抑菌效果,其EC50值均達0.05～1.12 μg/mL,表現(xiàn)為極度敏感;②20%抑霉唑EW、1.8%辛菌胺醋酸鹽AS及50%腐霉利WP對黑點病菌也具有良好的抑菌效果,其EC50值為14.02～37.37 μg/mL,表現(xiàn)為高度敏感;③5%氨基寡糖素SL其EC50值為118.49 μg/mL,為中度敏感;62%嘧環(huán)·咯菌腈WG和25%吡唑醚菌酯EC的EC50值分別為195.32 μg/mL和189.02 μg/mL,均表現(xiàn)為低度敏感;④10%苯醚甲環(huán)唑WG及40%百菌清WP對黑點病菌的抑菌效果差,EC50值分別為 1 736.87 μg/mL和2 904.23 μg/mL,遠大于350 μg/mL,為不敏感;⑤而50%多菌靈WP和80%甲基托布津WP及糖醇鈣(Ca≥180 g/L)AS、硝酸氨鈣(Ca≥18%,N≥15%)SG對獼猴桃黑點病菌毒力最差,基本無抑菌效果。

2.2 不同藥劑對獼猴桃黑點病田間防治效果

供試16種藥劑對獼猴桃黑點病在田間(表3)均表現(xiàn)出極顯著防治效果。其中:苯甲·丙環(huán)唑30% EC 450 g/hm2(2 000倍)防效最好,達到90.36%,顯著優(yōu)于其他藥劑處理;其次為氟唑菌酰羥胺·苯醚甲環(huán)唑20% SC 600 g/hm2(1 500倍)、嘧環(huán)·咯菌腈62% WG 600 g/hm2(1 500倍)、腈苯唑24%SC 900 g/hm2(1 000倍)、丙環(huán)唑·嘧菌脂18.7% SC 600 g/hm2(1 500倍)、啶酰·咯菌腈30% SC 900 g/hm2(1 000倍)及戊唑醇43%SC 450 g/hm2(2 000倍)6種藥劑處理,平均防效達到84.32%～86.9%;第3為烯 肟·戊唑醇20%SC 900 g/hm2(1 000倍)、抑霉唑20%EW 900 g/hm2(1 000倍)、寡糖·吡唑酯27% EW 900 g/hm2(1 000倍)、腐霉利50% WP 750 g/hm2(1 500倍)、氨基寡糖素5%SL 1 800 g/hm2+糖醇鈣SL 1 800 g/hm2(500倍)、吡唑醚菌酯25% EC 720 g/hm2(1 250倍)及硝酸氨鈣(SG) 1 500 kg/hm2(土施) 7種藥劑處理,平均防效達到64.94%～81.78%;而以苯醚甲環(huán)唑10%WG 600 g/hm2(1 500倍)及辛菌胺醋酸鹽 1.8%AS 900 g/hm2(1 000倍)2種藥劑處理防效略差,平均防效均低于60%,均低于硝酸氨鈣SG 1 500 kg/hm2土壤施用處理。

表3 不同化學藥劑處理對獼猴桃黑點病田間藥效試驗結果Table 3 Results of field efficacy test for 16 chemicals against kiwifruit black scab

3 討 論

明確殺菌劑對靶標菌的毒力,對于選擇靶標作物的防治藥劑具有重要的參考價值[12-13]。研究結果顯示,供試的21種藥劑除50%多菌靈WP、80%甲基托布津WP兩種殺菌劑及糖醇鈣、硝酸銨鈣兩種鈣肥外,均對獼猴桃黑點病菌(Diaporthephaseolorum)有顯著抑制作用并對病害有良好防治效果,其中烯肟·戊唑醇w=20%懸浮劑(SC)、啶酰·咯菌腈w=30% SC、戊唑醇w=43%SC、丙環(huán)·嘧菌酯w=18.7%SC、氟酰羥·苯甲唑w=20%SC、寡糖·吡唑酯w=27% EW、苯甲·丙環(huán)唑w=30% EC、抑霉·咯菌腈w=25% SE、腈苯唑w=24% SC、抑霉唑w=20% EW、辛菌胺醋酸鹽w=1.8% AS及w=50%腐霉利WP 12種藥劑對黑點病菌具有強的抑菌效果,其EC50值均達0.05～37.37 μg/mL,黑點病菌對其表現(xiàn)為極度敏感或高度敏感;氨基寡糖素w=5% AS、嘧環(huán)·咯菌腈w=62% WG和吡唑醚菌酯w=25% EC的EC50值分別為118.49 μg/mL、195.316 4 μg/mL和255.18 μg/mL,表現(xiàn)為中度敏感、或低度敏感;而苯醚甲環(huán)唑w=10% WG、百菌清w=40% WP、多菌靈w=50% WP、甲基托布津w=80% WP及糖醇鈣(Ca≥180 g/L)AS、硝酸氨鈣(Ca≥18%,N≥15%)SG分別對獼猴桃黑點病菌的抑菌效果差或無抑菌效果,其EC50值遠大于350 μg/mL,為不敏感。供試16種藥劑對獼猴桃黑點病田間防治效果極顯著,其中:苯甲·丙環(huán)唑w=30% EC 450 g/hm2、氟唑菌酰羥胺·苯醚甲環(huán)唑w=20% SC 600 g/hm2、嘧環(huán)·咯菌腈w=62%WG 600 g/hm2、腈苯唑w=24%SC 900 g/hm2、丙環(huán)唑·嘧菌脂w=18.7% SC 600 g/hm2、啶酰·咯菌腈w=30%SC 900 g/hm2及戊唑醇w=43% SC 450 g/hm27種藥劑處理平均防效達到 84.32%～90.36%;烯肟·戊唑醇w=20%SC 900 g/hm2、抑霉唑w=20% EW 900 g/hm2、吡唑醚菌酯w=25% EC 720 g/hm2、腐霉利w=50% WP 750 g/hm2、寡糖·吡唑酯w=27% EW 900 g/hm2及硝酸氨鈣(SP)1 500 kg/hm26種藥劑處理,平均防效達到64.92%～81.78%;而以苯醚甲環(huán)唑w=10% WG 600 g/hm2、辛菌胺醋酸鹽w=1.8%AS 900 g/hm2及氨基寡糖素w=5% SL 1 800 g/hm2+糖醇鈣SL 1 800 g/hm23種藥劑處理防效略差,平均防效為 47.77%～ 59.73%,均低于硝酸氨鈣SP 1 500 kg/hm2土壤施用處理。

室內(nèi)毒力測定和田間試驗結果顯示,寡糖·吡唑酯w=27% EW 900 g/hm2、辛菌胺醋酸鹽1.8% AS 900 g/hm2(1 000倍)雖對黑點病菌(Diaporthephaseolorum)具有極強的毒力或抑菌效果,病菌對其表現(xiàn)為極度敏感,但田間防治效果僅為60%上下,不甚理想;相反,62%嘧環(huán)·咯菌腈WG和25%吡唑醚菌酯EC的室內(nèi)毒力測定結果為低度敏感,其田間防效較為理想,達到80%左右,這可能與設置的藥劑劑量或濃度高低有關。因此,為進一步明確各藥劑在田間施用的最佳劑量或濃度,尚需對同一種藥劑設置不同劑量或濃度梯度進行田間藥效試驗。

室內(nèi)毒力測定結果還顯示,硝酸氨鈣SG對黑點病菌(Diaporthephaseolorum)無抑菌效果,但田間藥效試驗結果表明,土施農(nóng)用硝酸氨鈣SG 1 500 kg/hm2對獼猴桃黑點病具有良好的防治效果,平均防效達到64.92%,與筆者從2018-2020年連續(xù)3 a使用鈣肥的田間試驗結果一致,推測Ca2+的使用能提高果實果皮的抗病性以及生理生化作用;袁嘉瑋等[14]研究表明,鈣作為生物體生長發(fā)育過程中的必需元素,參與果樹體內(nèi)組織結構的形成、營養(yǎng)與生殖器官的發(fā)育、光合作用等植物生理過程以及保護酶系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的調(diào)控等植物生理生化發(fā)育進程,也參與果樹的生物與非生物脅迫。劉巍等[1]對翠香獼猴桃黑點病與果實礦質(zhì)元素失調(diào)相關性研究結果顯示,獼猴桃黑點病的發(fā)生與果實中Ca元素不足相關。植物侵染性病害發(fā)生是病原菌致病能力與寄主植物綜合作用的結果,鈣通過直接或間接抑制病原菌的生長發(fā)育及繁殖,從而提高植物的抗病性[15]。Babak等[16]及Buczkowska等[17]研究發(fā)現(xiàn),葉面噴施鈣可使病害如炭疽病的發(fā)病率降低,且對植物產(chǎn)量(如甜椒)和果品質(zhì)量有影響,因此含鈣藥劑對獼猴桃黑點病的影響及作用機理還有待深入探討。

氨基寡糖素w=5% SL對獼猴桃黑點病菌(Diaporthephaseolorum)的室內(nèi)毒力和田間防治效果顯示,其對該病原菌表現(xiàn)為中度敏感,且有一定防治效果。氨基寡糖素屬于寡聚糖類抗病誘導劑,其在多類作物上的應用及作用機制在國內(nèi)已有較多報道,寡聚糖類藥劑對煙草蝕紋病、西瓜花葉病、黃瓜白粉病等的抗病機制表明寡聚糖具有體外抑菌活性,可以誘導植物的抗病性[18],所以氨基寡糖素與其他藥劑綜合應用可以作為未來病害綠色防治研究的途徑之一。