基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及體外細(xì)胞實驗探討復(fù)方菝葜丹參擦劑抗白癜風(fēng)作用機制

賽力克阿拉·阿里汗, 曹仕辰, 木合布力·阿布力孜, 麥合蘇木·艾克木,艾克白爾·買買提, 趙婷婷

(新疆醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院, 2維吾爾醫(yī)學(xué)院, 烏魯木齊 830017)

白癜風(fēng)是一種由于黑素細(xì)胞功能異常、黑色素減少的皮膚常見疾病,流行病學(xué)調(diào)查顯示,在世界范圍內(nèi)的患病率約為0.5%～2%[1]。該病可發(fā)生在任何年齡段,且發(fā)病與種族、性別無關(guān)[2],其中青少年發(fā)病率最高,約占總白癜風(fēng)患者的32%～40%[3]。白癜風(fēng)發(fā)病部位不定,當(dāng)出現(xiàn)在面部、頸部和手部等部位時,會對患者造成不同程度的精神壓力,甚至產(chǎn)生抑郁心理,影響正常社交,白癜風(fēng)疾病還可導(dǎo)致銀屑病、斑禿、慢性蕁麻疹及甲狀腺疾病等其他免疫疾病[4-9]。白癜風(fēng)作為疑難雜癥,易診難醫(yī),需要長期綜合治療,治療成本高,治療有效率低[10]。復(fù)方菝葜-丹參擦劑(又名石榴皮菝葜提取液,國家發(fā)明專利號:ZL201711230949.0)是臨床實踐中應(yīng)用的經(jīng)驗配方制劑,由菝葜、丹參、雞血藤等8味中藥組成,具有祛風(fēng)除濕、活血解毒的功效,適用于外感風(fēng)邪,濕毒阻絡(luò)所致的白癜風(fēng)的治療。本配方因不同于一般外用制劑,對皮膚無任何刺激性,不產(chǎn)生皮損,適合于眼瞼、口腔周圍和粘膜等部位白癜風(fēng)的治療。復(fù)方菝葜丹參擦劑的成分復(fù)雜,治療白癜風(fēng)的物質(zhì)基礎(chǔ)研究較少,作用機制尚未清晰。本研究利用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù),探究復(fù)方菝葜丹參擦劑治療白癜風(fēng)的作用機制,通過體外促進(jìn)黑色素形成實驗對其功效進(jìn)行實驗驗證,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器Heracell CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司),IX73倒置顯微鏡(日本Olympus 公司),MultiskanGO酶標(biāo)分析儀(美國Thermo公司)。

1.2 試藥丹參、菝葜、雞血藤、土茯苓、紅花、石榴皮等中藥材飲片均購自烏魯木齊市百草堂藥店。氫氧化鈉(天津致遠(yuǎn)試劑有限公司,2021101018),0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司,25300062),甲氧沙林(8-MOP, 重慶華邦制藥有限公司,H50021839),DMEM 高糖培養(yǎng)基(美國 Sigma公司,AF29561079),胎牛血清(美國 Sigma公司,1644044),左旋多巴(L-dopa,阿拉丁試劑公司,D2116196),曲拉通X-100(天津化工研究所,20200605),細(xì)胞培養(yǎng)級二甲基亞砜(DMSO,美國Sigma公司),芒柄花素(維克奇生物科技有限公司,wkq22053108),木樨草素(維克奇生物科技有限公司,wkq22032309),消白酊擦劑(安徽徽本堂生物科技有限公司,20210607)。

1.3 細(xì)胞A375黑色素瘤細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞所。

1.4 方法

1.4.1 復(fù)方中藥材主要成分及成分對應(yīng)靶點的收集及篩選 利用TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/)數(shù)據(jù)分析平臺,以類藥性(Drug-likeness,DL)≥.18作為篩選指標(biāo),篩選出菝葜丹參復(fù)方中中藥材各類成分;并通過活性成分篩選出成分對應(yīng)的作用靶點,合并去重。通過UniProt(https:/www.uniprot.org)數(shù)據(jù)庫將其靶點名稱轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的基因symbol。

1.4.2 治療白癜風(fēng)潛在作用靶點的篩選 通過GEO(htpps://www.ncbi.nlm.nih. gov/pubmed/)平臺輸入“vitiligo”作為關(guān)鍵詞,搜索到GSE75819基因芯片為15名白癜風(fēng)患者與15名正常人基因差異比較,符合篩選條件。對篩選的基因芯片進(jìn)行整理,樣品分組后通過R語言的Limma包和pheatmap包,進(jìn)行運算和分析,篩選 LogFC的絕對值及校正后的P值獲得白癜風(fēng)差異基因,其中 Log FC 的絕對值>1,P<0.05。對篩選出的基因進(jìn)行差異分析,對差異基因繪制火山圖及基因熱圖,并將差異基因同TTD(http://db.idrblab.net/ttd)、OMIM(http:// www.Omim.org)、Drug Bank( https://www． Drugbank.ca)、及Gene Card(https://www.genecards.org)等數(shù)據(jù)庫搜索出的白癜風(fēng)相關(guān)基因靶點合并去重,運用Uniprot數(shù)據(jù)庫對其進(jìn)行蛋白名稱標(biāo)準(zhǔn)化。將藥物成分對應(yīng)靶點與疾病靶點映射取交集,繪制venn圖,二者的交集作為菝葜丹參復(fù)方治療白癜風(fēng)的潛在作用靶點。

1.4.3 活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將整理好的菝葜丹參復(fù)方中藥材活性成分及篩選出的潛在作用靶點文件導(dǎo)入 Cytoscape 3.8.0軟件,建立復(fù)方與疾病的“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò),其中節(jié)點(Node)代表活性成分及作用靶點,邊(Edge)代表活性成分與作用靶點的相互作用。通過CytoNCA程序,以連接度作為指標(biāo)篩選出菝葜丹參復(fù)方治療白癜風(fēng)排名20的活性成分。

1.4.4 蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過 String平臺(https://string-db. org/ cgi/input.pl)建立菝葜丹參治療白癜風(fēng)潛在靶點之間的互作網(wǎng)絡(luò)。參數(shù)物種選擇“智人”,最低要求交互作用程度“Minimum required interaction score”選擇中等置信度“Medium confidence(0.900)”,其他參數(shù)保持默認(rèn)數(shù)值,建立潛在靶點相互作用網(wǎng)絡(luò),并利用Cytoscape 3.8.0軟件的分析功能模塊“Network analysis”進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治?計算節(jié)點連接度(Degree)、中介中心性(BC)、接近中心性(CC)、局部平均連通性(LAC)、網(wǎng)絡(luò)中心性(NC)5個重要拓?fù)鋮?shù),以每個參數(shù)都大于潛在靶點中位數(shù)作為篩選指標(biāo),篩選出核心靶點。

1.4.5 關(guān)鍵靶點基因的基因本體(GO)富集分析和基因相互作用京都基因和基因組百科全書(KEGG)富集分析 通過R語言和 Bioconductor平臺(https:// www.bioconductor.org/)搜索復(fù)方治療疾病的潛在基因靶點的基因ID,在R語言中安裝“Colorspace”、“DOSE”、“Enrichplot”等依賴包,搜索匯總得到菝葜丹參復(fù)方治療白癜風(fēng)的主要生物學(xué)進(jìn)程和代謝通路并進(jìn)行富集分析,最后對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理,分析相關(guān)基因生物過程及信號通路對白癜風(fēng)的作用。

1.4.6 分子對接 通過PubChem(https://pubchem. ncbi.nlm. nih.gov)搜索并下載復(fù)方中藥材主要活性成分的平面結(jié)構(gòu),通過Chem-3D軟件得到活性化合物的3D結(jié)構(gòu),對此結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化,作為小分子配體保存。從PDB(https://www. rcsb.org)數(shù)據(jù)庫搜索下載疾病相關(guān)靶點的立體結(jié)構(gòu),利用Pymol清除水分子及其他配體分子,按照pdb格式保存?zhèn)溆谩⒌鞍追肿蛹芭潴w分子的pdb文件導(dǎo)入Pymol軟件處理并轉(zhuǎn)換為pdbqt格式文件,確定活性口袋。將處理好的小分子配體文件與靶蛋白大分子受體通過AutoDock Vina軟件進(jìn)行對接,計算結(jié)合能,并運用Pymol軟件繪制對接圖。

1.5 體外細(xì)胞實驗研究

1.5.1 藥液的提取制備 按照專利工藝以處方比例稱取中藥材粉末,加一定體積的含水乙醇,室溫浸泡過夜,回流提取1.5 h,濾過,濾渣再次同法回流提取,合并兩次的濾液,濃縮至浸膏,備用。陽性對照藥選用8-MOP與消白酊藥液,通過查閱文獻(xiàn)及實驗設(shè)計確定其最佳給藥濃度[11]。

1.5.2 細(xì)胞的培養(yǎng) 取A375細(xì)胞接種于高糖DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%雙抗)中,37℃、5% CO2的條件下在培養(yǎng)箱中培養(yǎng),次日換液。待細(xì)胞接近長滿,用胰酶消化傳代,繼續(xù)培養(yǎng)。每次實驗取自同一傳代細(xì)胞,做進(jìn)一步實驗。

1.5.3 細(xì)胞增殖活性測定(MTT法) 取對數(shù)生長期A375細(xì)胞,棄上清液,用磷酸緩沖溶液(PBS)洗滌2次,用胰酶消化培養(yǎng)細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度,配成2.5×104個/mL的細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板,每孔加細(xì)胞懸液100 μL,細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的藥液200 μL/孔,(每個質(zhì)量濃度設(shè)4孔,做3組),空白對照組加200 μL完全培養(yǎng)基,陽性對照藥為甲氧沙林(8-MOP),在24、48、72 h后各孔加入5.0 g/L MTT溶液20 μL,培養(yǎng)4 h后再加入DMSO 150 μL,37℃孵育10 min,使紫色晶體完全溶解,490 nm處測定吸光度(OD)值。

1.5.4 黑色素含量測定 取對數(shù)期A375細(xì)胞按照細(xì)胞數(shù)量為1×105個/mL,接種到96孔板中,每孔2 mL,待細(xì)胞完全貼壁,棄去培養(yǎng)液,用PBS洗滌,加入10、50、100、250、500 μg/mL含藥培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,棄培養(yǎng)液,用PBS洗滌2次,消化細(xì)胞,倒入離心管1 200 r/min離心5 min,棄去上清液,洗滌,加入含10%DMSO的1 mol/mL氫氧化鈉溶液1 mL,60°C水浴加熱1 h,加入96孔板,每孔100 μL,置酶標(biāo)儀中測定490 nm處OD值,每個濃度設(shè)4個復(fù)孔,取平均值,實驗重復(fù)3次。

1.5.5 酪氨酸酶活性測定 取對數(shù)生長期A375細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個/mL,培養(yǎng)板加入黑色素瘤A375細(xì)胞單細(xì)胞懸液每孔200 μL,待貼壁后加入含藥物的培養(yǎng)液(陽性對照組為甲氧沙林和消白酊藥液),分別繼續(xù)培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)液,用的磷酸緩沖溶液洗滌2次,每孔加入1%(體積分?jǐn)?shù))Triton X-100溶液90 μL,迅速置-80℃凍存1 h,隨后室溫融化使細(xì)胞完全裂解,37℃預(yù)溫后加入10 g/L多巴溶液100 μL,37℃反應(yīng)2 h,用酶標(biāo)儀中測定475 nm處OD值。

1.5.6 處方比例調(diào)整與細(xì)胞增殖活性測定 按照網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果,對處方中起主要作用的藥材進(jìn)行比例調(diào)整,按“1.5.3”項下的方法進(jìn)行實驗,驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果,確定復(fù)方君藥,優(yōu)化處方。

1.5.7 處方活性成分的篩選與驗證 按照網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接的結(jié)果,篩選出處方中的主要活性成分,探究成分對黑色素含量及酪氨酸酶活性的影響,將篩選出的木樨草素與芒柄花素成分配制成10 μmol/mL及50 μmol/mL濃度含藥培養(yǎng)基給藥,按“1.5.4”和“1.5.5”項下方法測定單體成分對酪氨酸酶活性及黑色素含量的影響。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方藥材的主要活性成分通過TCMSP數(shù)據(jù)庫收集復(fù)方藥材中的主要化學(xué)成分信息。篩選去重后得到106個主要成分。經(jīng)過Cytoscape3.8.0分析并按照degree值排序,取前20個活性成分。

2.2 復(fù)方藥材對應(yīng)靶點匯總結(jié)果通過TCMSP數(shù)據(jù)庫對復(fù)方中中藥材靶點進(jìn)行收集,再利用uniport數(shù)據(jù)庫對收集的蛋白名轉(zhuǎn)換基因名,并棄去重復(fù)靶點,共得到藥材相對應(yīng)靶點為260個。

2.3 治療白癜風(fēng)的潛在作用靶點篩選通過GEO平臺篩選出差異基因793個,并對lgFC>2的基因做熱圖,差異顯著,通過熱圖篩選差異基因作為疾病相關(guān)靶點與TTD、OMIM、Drug bank等數(shù)據(jù)庫的結(jié)合,共得到關(guān)于白癜風(fēng)的靶點1 920個,與藥材靶點映射交集得到治療白癜風(fēng)潛在靶點87個,見圖1、2。

圖1 白癜風(fēng)差異基因熱圖

圖2 潛在靶點venn圖

2.4 活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建結(jié)果以87個潛在作用靶點及106活性成分建立菝葜丹參提取液治療白癜風(fēng)的“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò),共有193個節(jié)點,表示所有成分與靶點數(shù)量,通過Cytoscape中CytoNCA程序以連接度為指標(biāo)進(jìn)行拓?fù)浞治?篩選出排名前20的成分,見表1。511條邊,表示成分-靶點相互作用關(guān)系,發(fā)現(xiàn)丹參(紅)與雞血藤(藍(lán))藥材成分與白癜風(fēng)疾病靶點連接數(shù)量最多,中間綠色方塊兒為作用靶點,外圍是藥物成分,紅色為丹參藥材成分、藍(lán)色為雞血藤成分、紫色為菝葜成分、綠色為紅花成分,見圖3。

表1 菝葜丹參復(fù)方連接度排名前20成分

圖3 藥物活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)

2.5 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)中有87個蛋白節(jié)點,196條邊,將 String平臺獲得的 TSV格式的PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入 Cytoscape軟件進(jìn)行拓?fù)浞治?其中,共有21個活性成分的BC、CC、Degree值、LAC、NC值均大于平均值,提示這些成分可能是該復(fù)方治療白癜風(fēng)的主要活性成分,對21個基因再次進(jìn)行篩選,選出對白癜風(fēng)治療作用最相關(guān)的核心基因,得到AKT1、ERS1、STAT3、RELA、TP53、MAPK1、MAPK14、MYC 8個核心基因,說明這8個蛋白靶點在菝葜丹參復(fù)方治療白癜風(fēng)疾病中發(fā)揮著重要的作用,是該復(fù)方治療白癜風(fēng)的核心靶點,見圖4。

圖4 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 菝葜丹參復(fù)方治療白癜風(fēng)的GO功能富集分析GO功能富集分析顯示,與生物過程(BP) 聯(lián)系的條目有2 086條,主要涉及到活性氧代謝過程、氧化應(yīng)激反應(yīng)、T細(xì)胞活化、金屬離子反應(yīng)等; 與分子功能(MF) 聯(lián)系的條目有139條,包括四吡咯結(jié)合、血紅素結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性信號受體激活劑、活性受體配體活性等; 與細(xì)胞組分(CC) 聯(lián)系的條目有35 條,主要涉及到外膜、細(xì)胞器外膜、泡腔胞漿等,見圖5。

2.7 菝葜丹參復(fù)方治療白癜風(fēng)的KEGG 通路富集分析KEGG富集結(jié)果有157條信號通路,主要包括AGE-RAGE相關(guān)通路、IL-17、TNF信號通路、Th-17細(xì)胞通路等免疫信號通路,都與白癜風(fēng)的治療相關(guān),見圖6。

2.8 分子對接經(jīng)過CytoNCA拓?fù)浞治黾癒EGG前20個通路靶點連接度,共同篩選出核心靶點為AKT1、ERS1、MAPK1、MAPK14、RELA、TP53、STAT3、MYC,此8個核心基因,經(jīng)過文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)TYR對白癜風(fēng)治療中起至關(guān)重要的作用,所以在分子對接驗證中加入了TYR基因,活性成分經(jīng)過連接度排序選擇前6個成分進(jìn)行分子對接,其中結(jié)合緊密的靶點與成分見圖7、8。

圖5 GO富集分析

圖6 KEGG信號通路富集分析

圖7 分子對接熱圖

(注: A: AKT1與木樨草素; B: AKT1與槲皮素; C: RELA與丹參酮IIA; D: MYC與芒柄花素)

2.9 體外黑色素細(xì)胞實驗結(jié)果

2.9.1 菝葜丹參搽劑對黑色素細(xì)胞增殖作用影響 8-MOP濃度為50 μmol/mL時對A375細(xì)胞增殖作用最強,因此選擇該濃度的8-MOP作為陽性對照,見圖9。菝葜丹參提取物濃度在10～100 μg/mL范圍內(nèi)對A375黑色素瘤細(xì)胞有一定的促增殖效果,給藥濃度為50 μg/mL時對黑色素細(xì)胞增殖效果最強,且高于陽性對照組,見表2。

2.9.2 菝葜丹參搽劑對酪氨酸酶活性及黑色素含量的影響 菝葜丹參提取物濃度在10～100 μg/mL范圍內(nèi)對酪氨酸酶的活性有較顯著的激活作用,同濃度下黑色素含量明顯提高,且高于陽性對照組,見圖10。

圖9 陽性對照藥給藥濃度確定

表2 菝葜丹參搽劑對黑色素細(xì)胞的增殖作用

(注:與陰性對照組比較, *P<0.05)

2.9.3 不同處方比例的菝葜丹參搽劑提取液對黑色素細(xì)胞的增殖作用 隨著丹參與雞血藤比例增加,處方對黑色素細(xì)胞增殖的抑制作用明顯增強,表明丹參與雞血藤是該處方的君藥,符合該處方的中醫(yī)學(xué)組方原理,見圖11。

2.9.4 單體成分對黑色素含量與酪氨酸酶活性的影響 木樨草素和芒柄花素對酪氨酸酶的活性有激活作用,能夠提高黑色素的含量,見表3。

表3 單體對黑色素含量與酪氨酸酶活性的影響

(注: 1號為雞血藤與丹參藥材低比例處方, 2號為雞血藤與丹參藥材高比例處方)

3 討論

白癜風(fēng)是一種病因尚不明確的后天性色素脫失性皮膚疾病。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為白癜風(fēng)發(fā)病機制主要與氣血瘀滯、風(fēng)邪致病、肝腎不足等有關(guān)[12]。現(xiàn)代中藥藥理學(xué)實驗顯示,中藥復(fù)方中的多種成分可通過作用于多個疾病相關(guān)靶點起到治療疾病的作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)方菝葜丹參擦劑中106個化學(xué)成分可作用于白癜風(fēng)相關(guān)的8個核心靶點,這些靶點涉及AGE-RAGE通路、Th17細(xì)胞分化、IL-17通路等多條信號通路,通過參與氧化應(yīng)激反應(yīng)、活性氧代謝反應(yīng)、炎癥免疫反應(yīng)等多種途徑,促進(jìn)酪氨酸酶的活性和黑色素的形成。有研究表明[13]AGE-RAGE通路下游級聯(lián)一部分CREB,通過激活MITF的cAMP反應(yīng)元件共識基序,從而激活酪氨酸酶,促進(jìn)黑色素細(xì)胞產(chǎn)生黑色素。Th17的分化可調(diào)節(jié)IL-17、IL-6、腫瘤壞死因子-α等炎癥因子的分泌,在免疫炎癥中起潛在作用,從而減少黑色素細(xì)胞損傷[14-15]。在體外藥理學(xué)實驗研究中,菝葜丹參提取液可提高酪氨酸酶的活性,促進(jìn)黑色素細(xì)胞的增殖,提高黑色素的含量,此結(jié)果對復(fù)方菝葜丹參治療白癜風(fēng)的作用機制及功效的物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論依據(jù)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示,復(fù)方菝葜丹參擦劑中丹參和雞血藤兩種藥材的多數(shù)成分與白癜風(fēng)疾病潛在靶點相關(guān),有研究表明丹參[16]能夠抑制CD-8T細(xì)胞募集,保護(hù)黑色素細(xì)胞不被破壞,且丹參中含有銅離子[17],能夠激活酪氨酸酶活性,因此丹參與雞血藤是該處方的君藥。通過對處方中丹參和雞血藤比例調(diào)整,體外藥理實驗結(jié)果顯示,降低丹參與雞血藤比例后處方對黑色素細(xì)胞增殖作用明顯降低,比例增加則處方活性顯著提高,表明丹參與雞血藤是該處方中的君藥成分,符合該處方的中醫(yī)學(xué)組方原理。

通過CytoNCA拓?fù)浞治龊Y選出配方功效相關(guān)的多個化學(xué)成分,發(fā)現(xiàn)丹參與雞血藤中的多種化學(xué)成分與激活酪氨酸酶的活性相關(guān),根據(jù)這一線索而開展的分子對接結(jié)果顯示,以上兩種藥材所含的木樨草素和芒柄花素的關(guān)聯(lián)性最顯著。且有研究表明木樨草素[18]能夠抑制受刺激的黑色素細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素8,從而抑制免疫細(xì)胞募集產(chǎn)生活性氧(ROS),而ROS對黑色素細(xì)胞有毒性作用。芒柄花素[20]通過激活酪氨酸酶活性的途徑,從而提高黑色素含量[19]。本研究從復(fù)方藥材中分離得到木樨草素和芒柄花素單體成分,通過體外藥理實驗驗證,發(fā)現(xiàn)兩種化學(xué)成分均能提高細(xì)胞中黑色素含量,其中木樨草素對酪氨酸酶具有較強的激活作用,對黑色素含量的提高效果尤為顯著,提示該有效成分具有天然先導(dǎo)化合物潛力,可進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾研究和創(chuàng)新候選藥物篩選。

綜上所述,菝葜丹參復(fù)方對黑色素細(xì)胞具有一定的促增殖作用,通過激活酪氨酸酶,提高黑色素的形成和細(xì)胞內(nèi)黑色素含量,其中有效成分木樨草素對酪氨酸酶激活作用較為顯著。本研究印證了菝葜丹參復(fù)方是通過多種成分、多種途徑作用到多靶點,最終對白癜風(fēng)產(chǎn)生了治療作用。