中藥復方緩壓樂對應激性高血壓大鼠內質網應激IRE1信號通路的影響

納菲沙·卡德爾, 阿依西布·薩吾提, 鐘 莉, 庫熱西·玉努斯

(新疆醫科大學1基礎醫學院, 2藥學院, 烏魯木齊 830017; 3新疆地方病分子生物學重點實驗室, 烏魯木齊 830054,4浙江大學醫學院公共技術平臺, 杭州 310000; 5新疆醫科大學維吾爾醫學院, 烏魯木齊 830017)

全球30～79歲的高血壓患者人數自1990年至2019年由6.48億增加到12.78億[1]。雖然近年來高血壓的治療已經取得了進展,但對高血壓患者血管并發癥的新療法開發仍然是至關重要的研究方向[2]。高血壓是遺傳和環境因素共同起作用的復雜性疾病。慢性應激在高血壓發生發展中起重要作用[3],但其具體病理生理學機制仍不清楚。大量研究表明,內質網應激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)參與高血壓、動脈粥樣硬化、血管鈣化、缺血性心臟病及心力衰竭等多種心血管疾病(Cardiovascular disease, CVD)的發生和發展,可作為治療多種CVD的重要靶點[4-6]。ERS信號通路的研究可能為開發高血壓新療法和預防其并發癥提供重要的依據。

課題組前期研究發現,應激性高血壓(Stress induced hypertension,SIH)大鼠模型中ERS標志分子葡萄糖調節蛋白78(Glucose-regulated protein 78/binding immunoglobulin protein,GRP78/BiP)的表達水平上調[7],初步證實SIH模型中ERS的存在。ERS的發生進而激發未折疊蛋白質反應(Unfolded protein response,UPR),激活其下游信號分子[4]。IRE1/XBP1通路是UPR三個重要信號通路之一[8]。X盒結合蛋白1(X-box binding protein-1,XBP1)作為核轉錄因子調控其下游基因mRNA表達水平。腎素-血管緊張素-醛固酮系統與高血壓發生密切關聯,其相關基因血管緊張素轉化酶(Angiotensin-converting enzyme,ace)和ANGII受體1型(ANGII type 1 receptor,at1r)的啟動子區均存在潛在的XBP1應答元件[9]。

中藥復方緩壓樂(HYL)是由本科研團隊根據民間降壓驗方組合而研制的。用HYL進行干預后,SIH大鼠收縮壓和舒張壓降低[10],但其具體機制不明,因此本研究在建立SIH大鼠模型的基礎上,用HYL進行干預,探討ERS信號通路相關蛋白的表達變化,為高血壓中藥防治提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 36只鼠齡為6～8周的SPF級Wistar大鼠,體重160～220 g,購買及飼養于新疆醫科大學動物實驗中心[SCXK(新)2016-0003]。

1.1.2 主要試劑與儀器 受磷蛋白(phospholamban,PLB)總蛋白、p-PLB、p-肌醇需求因子1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)及XBP1抗體(abcam,英國),DAB顯色試劑盒(陸壹科技,北京),免疫組化試劑盒(博士德生物,武漢),BCA試劑盒(索萊寶,北京),BSA封閉液(博士德生物,武漢),ECL化學發光底物(Biosharp,中國),無創血壓儀BP-600A(泰盟有限公司,成都),倒置顯微鏡(萊卡公司,德國)。

1.1.3 藥物 中藥復方緩壓樂主要藥物成分有倒提壺、玫瑰花、小茴香等,藥材均購自新疆維吾爾醫院。依普利酮片是一種新型的具有選擇性阻斷醛固酮受體的阻斷劑,有良好的降血壓作用。

1.2 方法

1.2.1 SIH模型制備 36只Wistar大鼠中隨機取6只作為正常組(不建模),剩余30只隨機分為模型組,高、中、低劑量藥物干預組和陽性對照組,每組6只,參照文獻[11]造模12周,造模期間使用無創血壓儀測定各組大鼠尾動脈收縮壓(Systolic blood pressure,SBP)和舒張壓(Diastolic blood pressure,DBP),每只大鼠測3次血壓,取平均值。以模型組12周應激刺激結束后測得的血壓與應激刺激開始前的初始血壓進行比較,收縮壓升高≥20 mmHg說明造模成功[12]。

1.2.2 動物給藥方法 高、中、低劑量藥物干預組和陽性對照組在給予間斷足底電和噪聲復合刺激的同時予以相應藥物干預12周。模型組大鼠每天灌胃蒸餾水(0.1 g/100 g體質量,1次/d),HYL藥物干預高劑量組(0.1 g/100 g體質量,1次/d)、中劑量組(0.05 g/100 g體質量,1次/d)、低劑量組(0.025 g/100 g體質量,1次/d)大鼠每天灌胃HYL。陽性對照組大鼠每天灌胃依普利酮溶液(0.005 g/100 g體質量,1次/d)。

1.2.3 收集樣本 取大鼠胸主動脈組織并分兩段,一段置于-80℃冰箱保存,備用于RT-qPCR及Western blot實驗。另一段放入包埋盒中固定于4%多聚甲醛溶液中,石蠟包埋,用于免疫組織化學(IHC)實驗。

1.2.4 RT-qPCR技術檢測胸主動脈組織ace和at1rmRNA表達水平 液氮研磨適量胸主動脈組織,使用Trizol試劑提取總RNA,測定其濃度,使用PCR循環儀進行逆轉錄。用RT-qPCR定量檢測ace和at1rmRNA表達量,用2-ΔΔCt分析法計算結果,引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.5 IHC技術檢測胸主動脈組織中XBP1的表達 將石蠟切片常規脫水,3%過氧化氫去除內源性酶,檸檬酸鈉修復抗原,5%BSA封閉液封閉,滴加一抗4℃過夜,HRP-山羊抗兔IgG30 min 37℃孵育,DAB顯色(顯微鏡下控制顯色時間),蘇木素復染,脫水、透明、中性樹膠封片。熒光倒置顯微鏡下觀察拍照,每只大鼠選取6張切片,每張切片隨機選4個視野。采用Image Pro Plus6.0軟件定量分析,計算各組大鼠累積光密度值(IOD),進行統計分析。

1.2.6 Western blot技術檢測胸主動脈組織PLB總蛋白、p-PLB、p-IRE1及XBP1的表達水平 液氮中研磨適量胸主動脈組織,加入RIPA裂解液提取蛋白。在4℃條件下,12 000 r/min離心10 min,取上清液,使用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。適宜條件下,進行電泳、轉膜、封閉、一抗孵育,二抗孵育等步驟。ECL化學發光試劑曝光顯影,Image J圖像分析法進行灰度值分析。

1.3 統計學分析采用SPSS21.0軟件進行數據統計分析,計量資料用均數±標準差表示,計量資料服從正態性時,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析;當計量資料不服從正態性時,組間比較采用秩和檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠尾動脈血壓的變化造模前,各組大鼠收縮壓和舒張壓無明顯差異(P>0.05);造模12周結束后,與正常組相比,模型組、HYL藥物干預中及低劑量組大鼠SBP和DBP升高(P<0.05),高劑量組與陽性對照組大鼠與正常組比較,SBP和DBP變化差異無統計學意義(P>0.05);與模型組相比,高劑量組與陽性對照組大鼠SBP和DBP降低(P<0.05),見圖1。

2.2 各組大鼠胸主動脈組織ace、at1r基因mRNA表達水平的變化與正常組相比,模型組大鼠胸主動脈組織ace和at1r基因mRNA表達水平均上調;與模型組相比,高、中、低劑量組和陽性對照組大鼠胸主動脈組織ace基因mRNA表達水平均下調(P<0.05),高劑量組和陽性對照組大鼠胸主動脈組織at1r基因mRNA表達水平均下調(P<0.05),見圖2。

注:與正常組比較, *P<0.05;與模型組比較, ΔP<0.05。

注:與正常組比較, *P<0.05; 與模型組比較, ΔP<0.05。

2.3 各組大鼠胸主動脈組織XBP1蛋白表達水平變化IHC染色中XBP1蛋白陽性表達定位于細胞核和/或細胞質,呈棕黃色,見圖3。與正常組相比,模型組和低劑量組大鼠胸主動脈組織血管平滑肌細胞中XBP1蛋白總表達量明顯增多(P<0.05);相對于模型組,高劑量組和陽性對照組中XBP1蛋白染色淡、陽性表達低,且總表達量明顯減少(P<0.05),中、低劑量組無明顯差異(P>0.05),見表2。

注: A, 正常組; B, 模型組; C, 高劑量組; D, 中劑量組; E, 低劑量組; F, 陽性對照組。

表2 各組大鼠胸主動脈組織XBP1蛋白表達水平變化

2.4 各組大鼠胸主動脈組織總PLB、p-PLB、p-IRE1、XBP1表達水平相較于正常組,模型組、中及低劑量組總PLB、p-IRE1、XBP1表達量均明顯上調(P<0.05),p-PLB表達量明顯下調(P<0.05);與模型組相比,高劑量組及陽性對照組中總PLB、p-IRE1、XBP1表達量均明顯下調(P<0.05),而p-PLB表達量明顯上調(P<0.05)。與正常組相比,模型組、中及低劑量組p-PLB/總PLB顯著下降(P<0.01);與模型組相比,高劑量組及陽性對照組p-PLB/總PLB顯著增加(P<0.01),見圖4。

注: 與正常組比較, *P<0.05, **P<0.01; 與模型組比較, ΔP<0.05, ΔΔP<0.01。

3 討論

長期處于模擬的應激刺激環境中,實驗動物會出現呼吸、心跳加快、血壓升高等“預警反應”,導致神經-內分泌-免疫系統紊亂,內穩態失衡,最終引發SIH的發生[13]。本研究發現,慢性電擊和噪聲刺激會引起大鼠SBP和DBP明顯上升,造模成功。用HYL干預后血壓明顯下降,以高劑量組尤為顯著。

內質網是極其敏感的細胞器,參與胞內蛋白質折疊和分泌、跨膜蛋白易位、鈣穩態和脂質生物合成等多種重要的細胞功能。非磷酸化的PLB抑制肌漿網鈣ATP酶(Sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase,SERCA)的活性,減弱肌漿網鈣回收作用[14]。[Ca2+]ER持續性降低是引起ERS的誘因之一。各種生理或病理刺激導致錯誤折疊和未折疊蛋白在內質網腔內積累,引起ERS[15]。本研究結果顯示,PLB總蛋白的表達上調且PLB磷酸化水平下調,提示PLB非磷酸化水平升高,即對SERCA活性起抑制作用,是SIH大鼠血管組織發生ERS的可能原因。HYL通過反向調節PLB總蛋白表達量及PLB磷酸化水平、增加SERCA活性,進而緩解ERS的發生。

ERS的發生進而激發UPR,激活其下游信號分子[4]。IRE1作為UPR目前已發現的三個分支之一,從酵母到哺乳動物都是最保守的,具有絲氨酸或蘇氨酸蛋白激酶和核糖核酸內切酶功能[4]。在應激狀態下,IRE1從GRP78解離,使自身磷酸化,觸發核糖核酸內切酶功能,引發XBP1 mRNA的非常規胞質剪接。未剪接的XBP1(XBP1u)不包含轉錄激活域,經由IRE1剪去26個核苷酸后移碼導致有效的轉錄因子——XBP1的生成[16]。XBP1被移位至細胞核中啟動轉錄,上調與蛋白質折疊、內質網相關降解(ER-associated degradation,ERAD)及內質網生成有關的基因表達[4,17]。Choi等[18]的研究發現,在自發性高血壓大鼠中,IRE1、XBP1表達上調,并用ERS抑制劑?；切苋パ跄懰?Tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)后其表達下調,且降低大鼠動脈收縮壓。本研究發現,XBP1在SIH模型組大鼠胸主動脈組織平滑肌細胞中高表達,而在HYL高劑量組中低表達。在SIH模型組中IRE1磷酸化水平及XBP1蛋白表達水平上調,而在HYL高劑量組中下調,提示在SIH模型中IRE1/XBP1信號通路處于活化狀態,高劑量HYL抑制此信號通路相關蛋白表達水平。有學者發現[9],在ace及at1r基因啟動子區均存在潛在的XBP1應答元件。IRE1/XBP1通路激活與ACE/ANGII/AT1R軸各成份在轉錄和蛋白質水平上上調表達有關。高劑量的中藥復方緩壓樂可以通過抑制該通路,降低腎素-血管緊張素-醛固酮系統相關基因ace和at1r的mRNA表達水平,進而起到降低血壓的作用。

綜上所述,中藥復方緩壓樂通過調節由慢性應激因素引起的SIH大鼠血管組織PLB的活性、且抑制IRE1/XBP1信號通路相關蛋白表達水平,降低血管組織ERS,從而發揮防治高血壓的作用,但是鑒于高血壓病理生理過程及其中藥復方干預機制的復雜性,有待進一步深入研究。