基于網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)初步探究準(zhǔn)噶爾烏頭炮制減毒的作用機(jī)制

李曉娟, 湯新樂(lè), 熱孜亞·艾力木江, 趙翡翠

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院, 烏魯木齊 830054; 2新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科, 烏魯木齊 830092;3新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部; 4新疆中藥炮制研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 烏魯木齊 830054)

準(zhǔn)噶爾烏頭(AconitumsoongaricumStapf.)為毛茛科植物準(zhǔn)噶爾烏頭的塊根,主產(chǎn)于新疆北部,其性辛、苦、大熱、有毒,多炮制減毒后使用,具有祛風(fēng)散寒、消腫止痛、通經(jīng)活絡(luò)的功效,臨床上主要用于鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤的治療[1]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)“加熱水煮”的炮制方法可降低準(zhǔn)噶爾烏頭的急性毒性,并驗(yàn)證了準(zhǔn)噶爾烏頭對(duì)心臟毒性的主要成分[2-3]。準(zhǔn)噶爾烏頭炮制品成分復(fù)雜,對(duì)其毒理學(xué)的研究主要集中在心肌細(xì)胞方面,未涉及到毒性靶蛋白[4-6]。傳統(tǒng)“單成分-單靶點(diǎn)-單通路”揭示心臟毒性機(jī)制具有一定局限性,可能會(huì)遺漏一些毒性成分和毒性靶點(diǎn),而通過(guò)網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)構(gòu)建“毒性成分-成分靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)-通路”多維網(wǎng)絡(luò)生物模型,能夠闡明復(fù)雜的分子機(jī)制。本研究采用網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)對(duì)準(zhǔn)噶爾烏頭心臟毒性作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè),挖掘其炮制產(chǎn)物中的心臟毒性成分和毒性靶點(diǎn),現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與試藥

心肌細(xì)胞H9c2(普賽諾生物公司),準(zhǔn)噶爾烏頭堿(成都曼斯特生物技術(shù)有限公司,A0824),烏頭堿(成都曼斯特生物技術(shù)有限公司,A0196),苯甲酰烏頭原堿(成都曼斯特生物技術(shù)有限公司,A0631),LY294002(MCE,HY-10108)。

2 方法

2.1 準(zhǔn)噶爾烏頭心臟毒性成分的篩選通過(guò)TCMSP 2.3[7](https://www.tcmsp-e.com/)和文獻(xiàn)檢索準(zhǔn)噶爾烏頭的化學(xué)成分,以O(shè)B≥20%,DL≥0.1為標(biāo)準(zhǔn)篩選活性成分,通過(guò)TOXNET數(shù)據(jù)庫(kù)挑選具有毒性的成分,得到準(zhǔn)噶爾烏頭中全部的毒性成分。

2.2 化合物-作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建在有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(kù)(Pubchem)[8](https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)中下載準(zhǔn)噶爾烏頭心臟毒性成分的2D結(jié)構(gòu)化學(xué)式,導(dǎo)入Pharmmapper數(shù)據(jù)庫(kù)[9](http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html)預(yù)測(cè)準(zhǔn)噶爾烏頭心臟毒性成分的靶點(diǎn),以“Normalized Fit Score>0.9”為基準(zhǔn)篩選高相關(guān)度靶點(diǎn),經(jīng)蛋白質(zhì)(Uniprot)數(shù)據(jù)庫(kù)[10](https://www.uniprot.org/)完成基因名(Gene Symbol)比對(duì)。采用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖[11]。

2.3 心臟毒性潛在靶點(diǎn)的獲取心臟毒性關(guān)鍵詞主要包括:心衰、心律不齊、房顫、心房撲動(dòng)、心動(dòng)過(guò)緩、心臟毒性等[12]。經(jīng)CTD數(shù)據(jù)庫(kù)[13](https://ctdbase.org/)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)[14](http://db.idrblab.net/ttd/)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)[15](https://disgenet.org)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)[16](https://www.genecards.org/)檢索心臟毒性相關(guān)靶點(diǎn)。將4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)信息的合集作為心臟毒性靶點(diǎn)。

2.4 準(zhǔn)噶爾烏頭心臟毒性關(guān)鍵靶點(diǎn)的獲取將“2.2”項(xiàng)下得到的毒性成分靶點(diǎn)與“2.3”項(xiàng)下檢索到的心臟毒性靶點(diǎn),經(jīng)Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)在線工具獲取準(zhǔn)噶爾烏頭心臟毒性的關(guān)鍵靶點(diǎn),繪制韋恩圖。

2.5 蛋白-蛋白相互作用(PPI)將關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入蛋白質(zhì)相互作用(String 11.5)數(shù)據(jù)庫(kù)[17](https://www.string-db.org/,去除游離靶點(diǎn),經(jīng)Cytoscape 3.7.2軟件可視化分析,用Cytohubb插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析,構(gòu)建PPI拓?fù)鋱D。

2.6 基因功能注釋和作用途徑分析使用R4.1.3軟件(https://bioconductor.org/)及相關(guān)程序包[18],繪制關(guān)鍵基因的基因本體(GO)功能分析和京都基因和基因組百科全書(KEGG)的氣泡圖和條形圖。

2.7 分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)采用分子對(duì)接完成準(zhǔn)噶爾烏頭主要毒性成分與核心靶點(diǎn)的結(jié)合模式預(yù)測(cè)。歸納“2.6”項(xiàng)下靶點(diǎn)和通路之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系,選擇前9個(gè)核心靶點(diǎn)和毒性成分。經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)獲取核心靶點(diǎn)蛋白晶體結(jié)構(gòu),Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)獲取化合物3D結(jié)構(gòu)。采用OpenBabel 2.3.2軟件(https://openbabel.org/)、PyMOL 2.2.0軟件(https://pymol.org/2/)、Autodock Tool(ADT)1.5.7軟件[19](https://autodock.scripps.edu/)對(duì)蛋白質(zhì)和化合物進(jìn)行文件格式轉(zhuǎn)換、加氫、去水、去配體等預(yù)處理,設(shè)置對(duì)接參數(shù)、生成活性口袋并運(yùn)行對(duì)接。以最低結(jié)合能的復(fù)合物作為優(yōu)勢(shì)模式構(gòu)象,對(duì)其氫鍵可視化分析[20]。

2.8 心肌細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

2.8.1 烏頭堿、準(zhǔn)噶爾烏頭堿和苯甲酰烏頭原堿母液的配制 用CMC-Na配制烏頭堿、準(zhǔn)噶爾烏頭堿和苯甲酰烏頭原堿的母液,濃度分別為:50、100、150 mg/mL,使用前用DMEM稀釋至所需濃度,混勻后使用。

2.8.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取復(fù)蘇心肌細(xì)胞H9c2至含有胎牛血清和青-鏈霉素中的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),待貼壁密度達(dá)到80%時(shí),加入0.25%胰酶溶液鋪于細(xì)胞平面,待75%左右細(xì)胞脫落時(shí)用無(wú)菌PBS沖洗停止消化,顯微鏡下調(diào)至合適的細(xì)胞密度傳代培養(yǎng)。

2.8.3 CCK-8法測(cè)定烏頭堿、準(zhǔn)噶爾烏頭堿和苯甲酰烏頭原堿的IC50取“2.8.2”項(xiàng)下對(duì)數(shù)期細(xì)胞,于DMEM完全培養(yǎng)基中制備單細(xì)胞懸液,接種至96孔板中,放入37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)24 h后,加入梯度濃度藥物(各6個(gè)復(fù)孔,檢測(cè)3次),繼續(xù)培養(yǎng)24 h,再加20 μL WST-8,培養(yǎng)2 h,檢測(cè)光密度值(A450),計(jì)算IC50,抑制率=(1-A濃度組/A對(duì)照組)×100%。

2.8.4 不同濃度烏頭堿、準(zhǔn)噶爾烏頭堿和苯甲酰烏頭原堿對(duì)心肌細(xì)胞形態(tài)的影響 按“2.8.3”項(xiàng)下方法制備單細(xì)胞懸液,置于96孔板中,培養(yǎng)24 h,空白組(空白完全培養(yǎng)基),處理組(烏頭堿的低、中、高濃度為0.2、0.4、0.6 mg/mL;準(zhǔn)噶爾烏頭堿的低、中、高濃度為0.3、0.6、0.9 mg/mL;苯甲酰烏頭原堿組的低、中、高濃度為0.5、1.0、1.5 mg/mL),各組處理24 h后,100倍倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.8.5 烏頭堿、準(zhǔn)噶爾烏頭堿和苯甲酰烏頭原堿的乳酸脫氫酶(LDH)漏出率 按“2.8.3”項(xiàng)下方法制備單細(xì)胞懸液,按“2.8.4”項(xiàng)下方法分組,置于96孔板中,培養(yǎng)細(xì)胞密度達(dá)到80%,加入處理組和空白組溶液,孵育,按LDH試劑盒說(shuō)明書測(cè)定490 nm處吸光度值,計(jì)算LDH漏出率[21]。另取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞,置于96孔板中培養(yǎng)24 h,貼壁,加入梯度濃度單體溶液,按細(xì)胞毒性試劑盒說(shuō)明書操作檢測(cè)不同濃度單體對(duì)細(xì)胞的毒性,分為3組,每組5個(gè)重復(fù)。

2.8.6 檢測(cè)烏頭堿、準(zhǔn)噶爾烏頭堿和苯甲酰烏頭原堿的心肌細(xì)胞凋亡 按“2.8.4”項(xiàng)下方法分組,取9×104個(gè)細(xì)胞,3 000 r/min離心10 min,棄去上層,加入250 μL Annexin V-FITC輕懸細(xì)胞,再加入10 μL Annexin V-FITC混勻,孵育15 min,3 000 r/min離心10 min,棄去上層,加入300 μL Annexin V-FITC重懸細(xì)胞,加入PI 15 μL,混勻,孵育10 min,篩網(wǎng)過(guò)濾,流式細(xì)胞儀檢測(cè)[22]。

3 結(jié)果

3.1 準(zhǔn)噶爾烏頭炮制品毒性成分篩選經(jīng)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和TOXNET數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到準(zhǔn)噶爾烏頭的心臟毒性成分18個(gè),見(jiàn)表1、圖1。

表1 準(zhǔn)噶爾烏頭炮制品心臟毒性成分

雙環(huán)戊二醚次烏頭堿亞油酸甲酯

3-脫氧烏頭堿準(zhǔn)噶爾烏頭堿多根烏頭堿

Izoteolin歐烏頭堿

3-乙酰烏頭堿、烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿草烏甲素、滇烏頭堿

環(huán)阿爾廷醇尼泊爾鳶尾異黃酮

圖1 準(zhǔn)噶爾烏頭炮制品18個(gè)毒性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

高烏甲素、氫溴酸高烏甲素烏拉爾寧

3.2 準(zhǔn)噶爾烏頭炮制品毒性成分靶點(diǎn)篩選檢索準(zhǔn)噶爾烏頭18個(gè)毒性成分相關(guān)靶點(diǎn),去重后保留73個(gè)唯一靶點(diǎn)?！八幬?毒性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖包含92個(gè)節(jié)點(diǎn)(1個(gè)藥物、18個(gè)毒性成分及73個(gè)靶點(diǎn)),312條邊,緊密度排名見(jiàn)表2,心臟毒性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。與靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)的成分為草烏甲素、烏拉爾寧、氫溴酸高烏甲素、高烏甲素和亞油酸甲酯、苯甲酰烏頭原堿等,見(jiàn)圖2。

3.3 準(zhǔn)噶爾烏頭-心臟毒性靶點(diǎn)篩選通過(guò)心臟毒性的關(guān)鍵詞共檢索到1 436個(gè)靶點(diǎn),去重后得到1 028個(gè)心臟毒性靶點(diǎn)。

3.4 準(zhǔn)噶爾烏頭潛在靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)韋恩圖的構(gòu)建運(yùn)用Venny 2.1.0在線工具,得到準(zhǔn)噶爾烏頭心臟毒性22個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn),制作韋恩圖,見(jiàn)圖3。以靶點(diǎn)名稱的縮寫表示,即:Sex Hormone Binding Globulin(SHBG)、Butyrylcholinesterase(BCHE)、Thyroid Hormone Receptor Beta(THRB)、Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma(PPARG)、Mitogen-Activated Protein Kinase 14(MAPK14)、Selectin P(SELP)、Coagulation Factor II,Thrombin(F2)、Transforming Growth Factor Beta Receptor 1(TGFBR1)、Bone Morphogenetic Protein 2(BMP2)、Estrogen Receptor 1(ESR1)、Glucosylceramidase Beta(GBA)、Caspase 7(CASP7)、Caspase 3(CASP3)、Matrix Metallopeptidase 3(MMP3)、Transthyretin(TTR)、Mitogen-Activated Protein Kinase 1(MAPK1)、Insulin Like Growth Factor 1 Receptor(IGF1R)、Plasminogen(PLG)、ADAM Metallopeptidase Domain 17(ADAM17)、Albumin(ALB)、Androgen receptor(AR)、Estrogen Receptor 2(ESR2)。

表2 心臟毒性成分與靶點(diǎn)的緊密度排名

3.5 PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及分析利用String數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建準(zhǔn)噶爾烏頭心臟毒性關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖,見(jiàn)圖4。網(wǎng)絡(luò)圖包含22個(gè)節(jié)點(diǎn)和81條邊,其以度值(DC)為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn),DC越大,表明該靶點(diǎn)對(duì)心臟毒性越重要。計(jì)算靶點(diǎn)DC、中介中心性(BC)、緊密中心性(CC)、馬修斯相關(guān)系數(shù)(MCC)的平均值,分別為7.36、14.09、14.11和528.90。DC、BC、CC、MCC都大于平均值的靶點(diǎn)有5個(gè):ALB、CASP3、MAPK1、ESR1、MAPK14;大于2倍以上平均值的靶點(diǎn)有1個(gè):ALB。17個(gè)成分(剔除1個(gè)未作用到靶點(diǎn)上的成分)和22核心靶點(diǎn)的對(duì)應(yīng)關(guān)系,見(jiàn)表3。

圖2 藥物-心臟毒性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 準(zhǔn)噶爾烏頭潛在靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)韋恩圖圖4 PPI蛋白相互作用圖

3.6 GO和KEGG分析用R軟件對(duì)22個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG分析,GO顯示976條富集結(jié)果,其中生物過(guò)程條目847個(gè),包括傷口愈合、生殖發(fā)育、細(xì)胞內(nèi)受體信號(hào)通路、跨膜受體蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶信號(hào)通路的正調(diào)控等。細(xì)胞組分條目23個(gè),包括血液微粒、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、血小板α顆粒和血小板α顆粒內(nèi)腔等。分子功能條目106個(gè),包括核受體活性、MAP激酶活性、激素結(jié)合和類固醇結(jié)合等。對(duì)各功能的前10條目信息繪圖,見(jiàn)圖5。KEGG結(jié)果顯示83條信號(hào)通路(P<0.05)主要涉及MAPK信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路等。以P值為篩選條件,對(duì)前30信號(hào)通路繪圖分析,見(jiàn)圖6。氣泡圖的橫坐標(biāo)代表面積,面積越大說(shuō)明通路中富集基因越多;縱坐標(biāo)代表P值,數(shù)值越小,顏色越紅,富集結(jié)果和信號(hào)通路越重要。

表3 準(zhǔn)噶爾烏頭心臟毒性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)的對(duì)應(yīng)關(guān)系

圖5 GO富集分析氣泡圖圖6 KEGG富集分析氣泡圖

3.7 分子對(duì)接驗(yàn)證

3.7.1 準(zhǔn)噶爾烏頭心臟毒性-分子對(duì)接 以“3.6”項(xiàng)中的KEGG結(jié)果為依據(jù),因MAPK14在Uniprot及PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有蛋白結(jié)構(gòu),選擇MAPK1、CASP3、TGFBR1、MMP3、BMP2、IGF1R、PPARG、TTR、ALB為受體;草烏甲素、亞油酸甲酯、烏拉爾寧、氫溴酸高烏甲素、高烏甲素、3-脫氧烏頭堿、烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、準(zhǔn)噶爾烏頭堿為配體進(jìn)行對(duì)接驗(yàn)證。配體與受體的結(jié)合能,見(jiàn)表4,熱圖見(jiàn)圖7,圖中顏色由紅變藍(lán),結(jié)合活性逐漸減弱。結(jié)果顯示配體與受體間有強(qiáng)烈的結(jié)合活性,配體與受體之間主要通過(guò)范德華力、H-鍵、Pi-Pi和Pi-Cation等作用力維持穩(wěn)定構(gòu)象。草烏甲素、烏拉爾寧、準(zhǔn)噶爾烏頭堿、烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿與ALB(6qio)的結(jié)合能分別為-14.2、-10.2、-10.0、-8.0、-8.6 kcal/moL。對(duì)形成氫鍵的復(fù)合物[烏拉爾寧、氫溴酸高烏甲素、高烏甲素與ALB(6qio)]進(jìn)行可視化分析,見(jiàn)圖8。

表4 核心心臟毒性化合物與核心心臟毒性靶點(diǎn)基因分子對(duì)接的結(jié)合能

圖7 9個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)與9個(gè)毒性成分的結(jié)合能熱圖

圖8 烏拉爾寧、氫溴酸高烏甲素、高烏甲素與6qio相互作用圖

3.7.2 準(zhǔn)噶爾烏頭炮制減毒的分子對(duì)接 課題組前期從準(zhǔn)噶爾烏頭中提取分離鑒定得到主要生物堿類成分為烏頭堿、脫氧烏頭堿、準(zhǔn)噶爾烏頭堿、12-表-歐烏堿和16,17-二氫-12β,16β-環(huán)氧歐烏頭堿。其中烏頭堿為C19雙酯型生物堿,毒性較大,含量高,是準(zhǔn)噶爾烏頭中的主要毒性成分。而烏頭堿經(jīng)“加熱水煮”法炮制后主要水解為單酯型的苯甲酰烏頭原堿,毒性僅為烏頭堿的1%～2%,大大降低了急性毒性,心臟毒性也隨之降低。而C20型生物堿準(zhǔn)噶爾烏頭堿在炮制過(guò)程中結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定未發(fā)生水解,心肌細(xì)胞毒性亦小于烏頭堿,但其炮制減毒的分子機(jī)制尚不清晰。本研究采用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)準(zhǔn)噶爾烏頭炮制前后主要特征成分烏頭堿、準(zhǔn)噶爾烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿,進(jìn)行炮制減毒的分子機(jī)制研究。比對(duì)表3中3個(gè)特征成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。取交集靶點(diǎn)PLG(5ugg)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。并對(duì)氫鍵復(fù)合物可視化分析,見(jiàn)圖9。5ugg與烏頭堿、準(zhǔn)噶爾烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿的對(duì)接結(jié)合能分別為-7.3、-6.1、-6.0 kcal/moL,故推測(cè)心臟毒性大小關(guān)系為:烏頭堿>準(zhǔn)噶爾烏頭堿>苯甲酰烏頭原堿。

圖9 烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿與5ugg相互作用圖

3.8 烏頭堿、準(zhǔn)噶爾烏頭堿和苯甲酰烏頭原堿的心肌細(xì)胞毒性結(jié)果

3.8.1 心肌細(xì)胞抑制率 烏頭堿、準(zhǔn)噶爾烏頭堿和苯甲酰烏頭原堿的IC50分別為0.357、0.617、1.070 mg/mL,心肌細(xì)胞毒性:烏頭堿>準(zhǔn)噶爾烏頭堿>苯甲酰烏頭原堿,各劑量組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表5。

3.8.2 細(xì)胞形態(tài)結(jié)果 空白組心肌細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形,處理組隨著干預(yù)濃度升高細(xì)胞體積變小,皺縮成橢圓形或成不規(guī)則形狀,胞體越亮,胞漿內(nèi)黑褐色斑點(diǎn)也增多。其中烏頭堿組的心肌細(xì)胞形態(tài)變化最明顯,毒性較大,苯甲酰烏頭原堿組的心肌細(xì)胞形態(tài)變化較小,毒性相對(duì)較低,見(jiàn)圖10-12。

表5 不同濃度藥物對(duì)心肌細(xì)胞抑制作用

圖10 烏頭堿空白(A)、低(B)、中(C)、高(D)濃度組心肌細(xì)胞形態(tài)圖

圖11 準(zhǔn)噶爾烏頭堿空白(A)、低(B)、中(C)、高(D)濃度組心肌細(xì)胞形態(tài)圖

圖12 苯甲酰烏頭原堿空白(A)、低(B)、中(C)、高(D)濃度組心肌細(xì)胞形態(tài)圖

3.8.3 LDH漏出率和凋亡率的測(cè)定結(jié)果 烏頭堿組、準(zhǔn)噶爾烏頭堿組和苯甲酰烏頭原堿組的LDH漏出率和凋亡率隨著濃度的升高而增加,呈劑量依賴性。各劑量組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表6。LDH漏出率實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)蜐舛葧r(shí)準(zhǔn)噶爾烏頭堿的心肌細(xì)胞毒性最大,而在中劑量和高劑量濃度時(shí),烏頭堿的心肌細(xì)胞毒性最大。烏頭堿的心肌細(xì)胞毒性是準(zhǔn)噶爾烏頭堿心肌細(xì)胞毒性的1.73倍,是苯甲酰烏頭原堿心肌細(xì)胞毒性的3倍。

表6 心肌細(xì)胞活性LDH和凋亡率

3 討論

本研究結(jié)果表明準(zhǔn)噶爾烏頭心臟毒性作用機(jī)制由準(zhǔn)噶爾烏頭堿、烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、3-脫氧烏頭堿、草烏甲素等成分作用于MAPK、TNF、IL-17、FoxO等信號(hào)通路,通過(guò)調(diào)控MAPK14、MAPK1、ALB、CASP3等靶點(diǎn)導(dǎo)致生物分子網(wǎng)絡(luò)紊亂,誘發(fā)心臟毒性。分子對(duì)接驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)毒性成分與毒性靶點(diǎn)有強(qiáng)烈的結(jié)合活性,當(dāng)烏頭堿、準(zhǔn)噶爾烏頭堿和苯甲酰烏頭原堿作用于PLG(5ugg)靶點(diǎn)時(shí),結(jié)合能依次降低,表明準(zhǔn)噶爾烏頭炮制減毒的作用機(jī)制與PLG(5ugg)靶點(diǎn)有關(guān)。結(jié)合心肌細(xì)胞H9c2實(shí)驗(yàn)結(jié)果,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)準(zhǔn)噶爾烏頭堿和主要炮制水解產(chǎn)物苯甲酰烏頭原堿的心肌細(xì)胞毒性均小于烏頭堿,其中烏頭堿的心肌毒性是苯甲酰烏頭原堿的3倍。證明準(zhǔn)噶爾烏頭炮制品的毒性大大降低,炮制達(dá)到了減毒的目的。準(zhǔn)噶爾烏頭與草烏、川烏在DNA分子、化學(xué)成分及藥理方面有親緣性關(guān)系,均含有C19烏頭型生物堿[23-26]。由于準(zhǔn)噶爾烏頭基礎(chǔ)研究較薄弱,故以烏頭類藥材親緣性特點(diǎn)將草烏、川烏納入檢索范圍,以期從烏頭類復(fù)雜化學(xué)成分和毒性體系中挖掘準(zhǔn)噶爾烏頭潛在毒性成分和心臟毒性靶點(diǎn),為后續(xù)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供依據(jù)。

準(zhǔn)噶爾烏頭心臟毒性作用途徑有MAPK信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路等,其中MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為胞內(nèi)調(diào)控炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要通路,其家族中已被鑒定的基因包括胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(Erk1/2)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)等[27]。在阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)證明激活p38MAPK活性會(huì)導(dǎo)致心臟重塑和心室擴(kuò)張,進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重的心肌疾病,抑制p38MAPK的激活對(duì)心肌損傷有保護(hù)作用[28]。Guo 等[29]研究發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)/分化因子(Gdf15)可通過(guò)MAPK/ERK1/2途徑促進(jìn)心臟細(xì)胞纖維化,而誘發(fā)心臟病,因此抑制MAPK信號(hào)通路的激活可降低心臟疾病的發(fā)生。IL-17是由細(xì)胞亞群Th17產(chǎn)生的特異性促炎細(xì)胞因子,其能促使IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放,引起機(jī)體炎癥反應(yīng)[30]。研究證明[31]IL-17在室性心肌重塑中起關(guān)鍵作用,心室結(jié)構(gòu)重塑主要表現(xiàn)為心室纖維化和心肌細(xì)胞凋亡,通過(guò)降低IL-17的表達(dá)水平,能抑制心室纖維化和心肌細(xì)胞凋亡從而對(duì)心室和心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用[32]。FoxO因子是叉頭轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子大家族的一個(gè)亞類,具有特定的DNA結(jié)合基序,其亞組包括FoxO1、FoxO3、FoxO4和FoxO6,其中FoxO1在心血管形態(tài)改變和代謝應(yīng)激誘導(dǎo)心臟重塑中具有關(guān)鍵作用,FoxO1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì),若磷酸化發(fā)生降解,則失去調(diào)節(jié)靶基因能力,加劇心肌的缺血性損傷。FoxO3缺乏會(huì)造成心臟肥大敏感,而FoxO4缺乏則會(huì)對(duì)心臟的缺血性損傷起保護(hù)作用,FoxO因子在心臟重塑有著不可或缺的作用[33-34]。

綜上所述,網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)以高效、合理的毒效評(píng)價(jià)方法預(yù)測(cè)藥物的毒性成分和毒性靶點(diǎn),提高了毒性目標(biāo)成分和靶點(diǎn)識(shí)別的特異性和靈敏性。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)對(duì)準(zhǔn)噶爾烏頭心臟毒性的成分和作用靶點(diǎn)進(jìn)行全面預(yù)測(cè),與傳統(tǒng)毒理學(xué)心肌細(xì)胞驗(yàn)證相比,有利于精準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)分子層面的毒性靶點(diǎn)。本研究挖掘出的毒性靶點(diǎn)有MAPK14、ALB、CASP3、TGFBR1、IGF1R、MMP3、BMP2、PPARG等,為后續(xù)準(zhǔn)噶爾烏頭心臟毒性作用機(jī)制的深入研究奠定了基礎(chǔ)。