慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉患者鼻黏膜組織HIF-1α、MUC5AC表達與糖皮質激素抵抗的關系

鐘 爍, 苗 偉

(開灤總醫院耳鼻喉科, 河北 唐山 063000)

慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉(CRSwNP)是由于多種因素造成的鼻黏膜炎癥病變,一般發生在鼻黏膜以及副鼻竇區域[1]。CRSwNP是耳鼻喉科常見的疾病,患者表現出流涕、鼻塞、疼痛等癥狀,嚴重者會出現嗅覺障礙,病程一般超過12周,在我國的發病率為8%～15%[2]。臨床研究顯示,年齡越大其患病風險越高,一般發病集中于35～59歲人群[3]。糖皮質激素是有效的抗炎和免疫抑制劑,是治療CRSwNP的一線藥物[4]。臨床上常采用短期口服潑尼松龍等糖皮質激素治療CRSwNP,但部分患者表現出糖皮質激素抵抗,導致治療效果不佳。黏蛋白5AC(MUC5AC)是氣道上皮細胞中表達的一種黏蛋白,CRSwNP患者呼吸道發生炎癥反應后會引起MUC5AC大量分泌[5]。誘導缺氧因子-1α(HIF-1α)是炎癥反應所刺激的信號通路中重要的轉錄因子之一,可以促進MUC5AC分泌[6]。Yu等[7]研究顯示,HIF-1α與CRSwNP患者的氣道炎癥和糖皮質激素抵抗有關。本文對關于CRSwNP患者鼻黏膜組織HIF-1α、MUC5AC表達與糖皮質激素抵抗關系進行探究,以期為臨床預測CRSwNP糖皮質激素抵抗,以及時調整治療策略獲得更好的臨床效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取開灤總醫院耳鼻喉科2017年8月至2022年6月接診的160例慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉患者為研究對象,其中男性88例,女性72例;年齡30～53歲,平均(39.19±6.16)歲。診斷標準:(1)符合《慢性鼻-鼻竇炎診斷和治療指南(2012昆明)》[8]中慢性鼻-鼻竇炎臨床癥狀診斷標準:鼻塞,有黏性或黏膿性鼻涕,自覺頭面部脹痛,嗅覺減退或喪失;(2)鼻竇CT顯示鼻竇黏膜或竇口鼻道復合體有炎性病變;(3)鼻內鏡檢查有鼻息肉,且可觀察到鼻黏膜充血、中鼻道和嗅裂有黏膿性分泌物。納入標準:(1)發生上述臨床癥狀時間≥12周;(2)入院前1個月未接受過激素、抗生素或其他治療鼻炎的藥物治療;(3)患者及家屬知情同意。排除標準:(1)合并萎縮性鼻炎;(2)合并支氣管擴張、上呼吸道慢性炎癥等;(3)依從性較差者。本研究已通過醫院倫理委員會批準。

1.2 治療與分組治療方案:給予160例患者口服潑尼松龍(醋酸潑尼松龍片,5 mg×100片/瓶,國藥準字H31020771,天津信誼津津藥業有限公司),0.5 mg·kg-1·d-1連續服用14 d。分組依據:治療前、治療后分別參照鼻息肉內鏡評分系統進行評分[9],分別從3個維度進行評價:(1)鼻息肉:無息肉記0分,息肉僅存在于中鼻道記1分,息肉存在范圍超過中鼻道記2分;(2)分泌物:無分泌物記0分,分泌物稀薄記1分,分泌物黏稠記2分;(3)黏膜水腫:無水腫記0分,輕度水腫記1分,嚴重水腫記2分;以上3個維度得分相加即為總分。與治療前相比,治療后評分下降≥1分的患者為正常組,評分下降<1分的為抵抗組。

1.3 檢測指標口服激素治療前,取所有患者適量鼻黏膜組織,分為兩部分。(1)取一部分鼻黏膜組織進行免疫組化觀察HIF-1α、MUC5AC的表達位置:將鼻黏膜組織用4%多聚甲醛固定,進行常規石蠟包埋并切片,將切片脫蠟脫水處理,用冰冷的PBS緩沖液洗3次,在檸檬酸鹽緩沖液中浸泡5 min,95℃水浴鍋中溫育20 min,在3%過氧化氫溶液中浸泡10 min,與適量HIF-1α、MUC5AC一抗(1∶500稀釋,美國Abcam公司)在4℃下孵育一晚,PBS緩沖液沖洗2次,加適量辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶500稀釋,美國Abcam公司)在37℃下孵育30 min,PBS緩沖液沖洗2次,用DAB進行顯色處理(3～15 min),PBS緩沖液沖洗2次,用蘇木素復染,進行常規脫水、透明,中性樹脂封片后,在光鏡下觀察染色情況,400倍視野下可見陽性細胞在顯微鏡下呈棕褐色。(2)取另一部分鼻黏膜組織進行RT-PCR檢測其中HIF-1α、MUC5AC的表達:將鼻黏膜組織制備成組織勻漿液,用Trizol法(上海翌圣生物科技有限公司)提取mRNA,提取后采用采用Qubit4.0核酸定量儀熒光計(美國賽默飛世爾科技有限公司)檢測提取出的mRNA濃度,用一步法RT-qPCR試劑盒(上海翌圣生物科技有限公司)先進行逆轉錄,再以互補脫氧核糖核酸(complementary Deoxyribonucleic acid,cDNA)為模板進行qRT-PCR擴增,引物序列見表1。反應條件如下:42℃ 30 min(1×),94℃ 5 min(1×),95℃ 15 s+60℃ 1 min(35×)。以β-actin為內參基因,采用2-(△△Ct)計算目的基因的相對表達量。

表1 目標基因引物序列

2 結果

2.1 兩組患者的臨床基線資料比較經比較,正常組和抵抗組患者的性別、年齡、病程、吸煙史和家族史等臨床基線資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。治療前鼻內鏡下可見鼻黏膜水腫、鼻咽部白色泡沫狀分泌物(圖1A、1B);治療后鼻內鏡下可見鼻腔癥狀明顯改善,鼻咽部基本無分泌物(圖1C、1D)。

表2 兩組慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉患者的臨床基線資料的比較

(注:A、B:治療前鼻黏膜水腫、鼻咽部白色泡沫狀分泌物;C、D:治療后鼻腔癥狀明顯改善,鼻咽部基本無分泌物)

2.2 鼻黏膜組織免疫組化和RT-PCR結果抵抗組患者鼻黏膜組織中HIF-1α和MUC5AC mRNA的表達高于正常組(P<0.05),見表3。經免疫組化染色,可見HIF-1α主要在細胞核中表達,在細胞質中部分表達,抵抗組表達水平高于正常組;MUC5AC主要在細胞質內表達,抵抗組表達水平高于正常組。見圖2。

表3 兩組患者鼻黏膜組織中HIF-1α與MUC5AC mRNA水平的比較

(注:A:HIF-1α在正常組患者鼻黏膜組織上的表達;B:HIF-1α在正常組患者鼻黏膜組織上的表達;C:MUC5AC在抵抗組患者鼻黏膜組織上的表達;D:MUC5AC在抵抗組患者鼻黏膜組織上的表達)

2.3 HIF-1α與MUC5AC mRNA表達之間的相關性經Pearson相關性分析,患者鼻黏膜組織中HIF-1α與MUC5AC mRNA表達之間呈正相關(r=0.582,P<0.05)。見圖3。

2.4 慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉患者糖皮質激素抵抗的Logistic回歸分析以性別、年齡、病程、吸煙史、家族史及HIF-1α、MUC5AC mRNA表達水平為自變量,糖皮質激素抵抗情況為因變量(正常=0,抵抗=1),進行單因素和多因素Logistic回歸分析,結果顯示,HIF-1α與MUC5AC mRNA表達水平為影響糖皮質激素抵抗發生的獨立危險因素(OR=3.268、3.057,P<0.05)。見表4。

圖3 HIF-1α與MUC5AC mRNA表達的相關性

表4 慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉患者糖皮質激素抵抗的單因素和多因素Logistic回歸分析

2.5ROC曲線分析對HIF-1α與MUC5AC mRNA表達水平進行ROC曲線分析,結果顯示,以HIF-1αmRNA表達水平≥0.549為預測糖皮質激素抵抗的分割點,曲線下最大面積為0.804,靈敏度為68.70%,特異度為86.21%。以MUC5AC mRNA表達水平≥0.543作為預測糖皮質激素抵抗的分割點,曲線下最大面積為0.706,靈敏度為76.34%,特異度為75.86%。見圖4。

圖4 HIF-1α與MUC5AC mRNA水平預測糖皮質激素抵抗的ROC曲線

3 討論

臨床研究發現,慢性阻塞性肺炎、哮喘、變應性鼻炎等慢性氣道炎癥疾病患者在接受糖皮質激素治療后均有可能出現抵抗現象[10-11]。因此及時有效地發現糖皮質激素抵抗對盡早改變治療方案、控制疾病發展具有重要意義。但目前為止,尚未發現有效的可以預測CRSwNP患者糖皮質激素抵抗發生的生物指標。

MUC5AC是一種呼吸道黏蛋白,CRSwNP患者的鼻粘液中含有大量的MUC5AC[12]。HIF-1α是HIF-1的亞型之一,在機體炎癥反應的發生過程中具有重要作用,可促進MUC5AC分泌,引發氣道中膿性分泌物的聚集[13]。既往研究顯示,CRSwNP患者鼻息肉組織中HIF-1α mRNA表達升高,其表達量不僅與中性粒細胞的數量呈正相關,而且與患者糖皮質激素抵抗有關[7]。本研究結果顯示,抵抗組患者鼻黏膜組織中HIF-1α和MUC5AC mRNA的表達高于正常組,提示糖皮質抵抗患者鼻黏膜中HIF-1α和MUC5AC表達升高。

目前CRSwNP的發病機制尚不明確,但是有研究顯示其發病原因可能與Th2細胞因子的表達增加密切相關。糖皮質激素由于其抗炎和免疫調節功能而被用于治療一系列鼻部炎癥疾病,如CRSwNP、變應性肺炎等,其主要通過與糖皮質激素受體α結合,促進抗炎基因表達來發揮抗炎作用。研究顯示糖皮質激素受體異常、激素活性酶異常、中性粒細胞增多等因素均可能導致糖皮質激素抵抗[14]。氣道和鼻竇中粘液分泌過多是CRSwNP的主要臨床特征,MUC5AC又是粘液中主要的大分子成分,其分泌受到HIF-1α的調節[15]。HIF-1α由巨噬細胞、中性粒細胞、樹突細胞和淋巴細胞表達,是缺氧反應的核心成分。HIF-1α可以通過調節下游因子的表達,增加血管通透性和組織水腫,促進上皮細胞向間充質細胞的轉化,在鼻息肉的發病機制中發揮作用[16]。

本研究經Pearson相關性分析發現,患者鼻黏膜組織中HIF-1α與MUC5AC mRNA表達之間呈正相關,經多因素Logistic回歸分析發現,HIF-1α高表達、MUC5AC高表達是糖皮質激素抵抗發生的獨立危險因素。Xu等[17]研究顯示,支氣管氣道中MUC5AC的分泌與HIF-1α有關,與本研究結果一致。本研究進一步行ROC曲線分析,結果顯示以HIF-1αmRNA表達水平≥0.549和MUC5AC mRNA表達水平≥0.543作為預測糖皮質激素抵抗的分界點具有較高的靈敏度和特異度,提示HIF-1α和MUC5AC的表達可以作為預測CRSwNP患者糖皮質激素治療發生抵抗的重要指標。史志芳等[18]研究顯示,MUC5AC在CRSwNP患者中呈高表達,并且對CRSwNP具有一定的診斷價值,與本研究結果相似,說明HIF-1α和MUC5AC的表達可以作為預測CRSwNP患者糖皮質激素治療發生抵抗的指標。

綜上所述,慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉患者鼻黏膜組織中HIF-1α與MUC5AC的表達呈正相關,可以作為預測糖皮質激素治療慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉患者臨床療效的指標。但本研究并未對其詳細機制進行探究,因此將在下一步研究中,對HIF-1α與MUC5AC的表達對糖皮質激素抵抗的詳細機制與影響進行系統的探究。