STC2介導內質網應激在甲基苯丙胺致神經細胞凋亡中的作用研究

馮向陽, 閆 杰,, 張金龍, 王郁芳, 嚴 赫, 魏新榮, 牛淑亮

(1新疆醫科大學基礎醫學院, 烏魯木齊 830017; 2中南大學基礎醫學院法醫系, 長沙 410000;3新疆醫科大學基礎醫學院解剖學教研室, 烏魯木齊 830017)

甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH)是一種強效的精神興奮劑,是全球濫用最廣泛的非法藥物之一[1]。除了成癮性,METH對中樞神經系統,特別是對多巴胺能神經細胞具有很強的毒性作用[2]。METH可誘導細胞死亡,包括壞死、焦亡、凋亡等。內質網應激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)通路是死亡受體信號通路和線粒體通路之外的經典凋亡通路,參與多種神經退行性疾病,包括帕金森和阿爾茨海默癥[3]。ERS涉及的轉錄激活因子6(Activating transcription factor 6,ATF6)、肌醇需求酶1(Inositol-requiring enzyme 1,IRE1)和蛋白激酶 RNA 樣內質網激酶(Protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase, PERK)等在ERS時與葡萄糖調節蛋白78(Glucose-regulated protein 78/binding immunoglobulin protein,GRP78)分離并激活[4],減輕細胞應激,使細胞存活,但強烈的應激會上調CCAT 增強子結合蛋白同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)的表達,激活凋亡通路,誘導細胞發生凋亡[5]。METH可上調大鼠紋狀體中GRP78、CHOP、剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白激酶12(Cleaved caspase12)和剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白激酶3(Cleaved caspase3)的表達[6],表明ERS凋亡通路在METH毒性機制中起重要作用,然而具體機制尚不清楚。斯鈣素2(Stanniocalcin2, STC2)屬于斯鈣素家族基因,可調節鈣和磷酸鹽穩態,協調應對各種應激,包括輻射、缺氧和ERS[7],多表達于哺乳動物腦內[8],參與線粒體和內質網(Endoplasmic reticulum, ER)的亞細胞功能,在氧化應激和ERS時具有細胞保護特性[9]。在結直腸癌中促進腫瘤細胞增殖[10],而在乳腺癌中,卻抑制癌細胞的增殖及細胞集落[11],同時STC2在缺血刺激時迅速上調以抵抗應激[12]。有研究表明,STC2可促進小鼠周圍神經損傷后再生[13]。沉默STC2后,毒胡蘿卜素誘導的小鼠腦神經瘤細胞(Mouse neuroblastoma neuro-2a cells, N2a)ERS和凋亡明顯加強[14],說明STC2具有神經保護作用,但METH誘導ERS凋亡通路相關研究較少。本研究旨在通過在體內外沉默STC2表達,探討STC2在METH誘導的神經元凋亡中的作用機制,為METH毒性機制相關靶點提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性SD大鼠,體重200～220 g,24只(湖南斯萊克公司),飼養在環境溫度(23±2)℃,濕度(50±5)%,自由飲水取食,保持12 h/12 h的光照黑暗周期。所有實驗程序均符合中南大學湘雅三醫院醫學倫理委員會倫理規范。

1.2 細胞培養與分組PC12細胞在10%胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)和1%雙抗的高糖培養基(Dulbecco′s modified eagle medium, DMEM),37℃的條件下培養, 2～3 d傳代一次。用0、1、1.5、2.0、2.5 mM METH處理24 h,收集細胞,并按劑量分為0 mM組、1 mM組、1.5 mM組、2 mM組和2.5 mM組。

1.3 試劑和儀器METH由長沙市公安局提供。PC12細胞(武漢普諾賽公司)。DMEM、磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate belanced solution, PBS)、胎牛血清、胰酶、青霉素鏈霉素溶液均購自美國Gibco公司。siRNA、GP-transfect-Mate轉染試劑購自上海吉碼公司。STC2抗體、GRP78抗體、caspase12抗體均購自英國Abcam公司。CHOP抗體、β-Tubulin抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體、caspase3抗體均購自武漢三鷹公司。山羊抗小鼠、抗兔二抗購自武漢伊萊瑞特公司。Evo M-MLV反轉錄試劑盒、SYBR? Green Pro Taq HS qPCR試劑盒(湖南艾科瑞公司)。PCR引物(長沙擎科公司)。TUNEL試劑盒(上海碧云天公司)。Annexin V-FITC凋亡試劑盒(南京凱基公司)。PCR儀(美國ABI公司)。腦立體定位儀、小動物麻醉系統均購自深圳瑞沃德公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 qRT-PCR檢測mRNA表達水平 使用Steady Pure Quick RNA Extraction Kit試劑盒提取總RNA。用Evo M-MLV反轉錄試劑盒進行逆轉錄。用SYBR? Green Pro Taq HS qPCR試劑盒進行qRT-PCR檢測。反應體系:2X SYBR? Green Pro Taq HS Premix(ROX Plus)10 μL,上下游引物(0.01 mM)0.8 μL,cDNA 2 μL,無RNA酶水7.2 μL。內參為GAPDH,mRNA相對表達水平用(RQ)=2-△△Ct統計,引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4.2 Western blot檢測STC2及內質網應激凋亡相關蛋白表達水平 RIPA提取細胞和組織蛋白,二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid, BCA)法檢測蛋白濃度。凝膠電泳后轉膜,37℃封閉1 h。加入STC2抗體(1∶1 000)、GRP78(1∶2 500)、CHOP抗體(1∶3 000)、Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶1 000)、caspase12 (1∶1 000)、caspase3(1∶1 000)、β-Tubulin(1∶5 000),4℃孵育過夜。加入二抗(1∶5 000),37℃孵育1 h。增強型化學發光試劑(Enhanced chemiluminescence, ECL)顯影,用Image J計算灰度值。

1.4.3 細胞轉染 PC12細胞鋪于6孔板內進行轉染,并分為siRNA-NC組、siRNA-NC+METH組、siRNA-STC2組和siRNA-STC2+METH組,各6只。在離心管中加入200 μL DMEM、150 pmolsiRNA,混勻,靜置5 min;另一離心管中加入200 μL DMEM、7.5 μL轉染試劑,靜置5 min;混勻2個離心管,靜置15 min,轉染,48 h后Western Blot檢測沉默效率,篩選效率最高siRNA,進行后續轉染實驗,siRNA序列見表2。

表2 siRNA序列

1.4.4 TUNEL檢測凋亡率 制作細胞涂片和石蠟切片。加入50 μLTUNEL檢測液,37℃避光孵育60 min。滴加DAPI,避光孵育5 min。熒光顯微鏡下拍照,Image J計算TUNEL和DAPI雙陽性細胞百分比。

1.4.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率 收集細胞,PBS洗滌1次,1 000 r/min離心5 min,200 μL Binding buffer重懸。滴加2 μL Annexin V-FITC、2 μL碘化丙啶混勻,避光孵育5 min,流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.4.6 體內基因沉默 大鼠固定于立體定位儀,10 μL注射器將siRNA-NC或siRNA-STC2(5 nmoL)以0.5 μL/min注入紋狀體(前囟前1.0 mm,外側3.0 mm,硬膜下4.5 mm), 停留5 min后拔出(1 mm/min)。48 h后, 腹腔注射生理鹽水或METH(10 mg/kg, 4次,間隔2 h),最后一次注射24 h后進行灌注取材[15]。1%戊巴比妥麻醉大鼠,固定于鼠臺上,剪開胸腹部皮膚后沿兩側肋骨剪開,暴露心臟。灌注針從左心室心尖部插入,落空感后用止血鉗固定。在右心耳處剪一小口。生理鹽水進行灌注,直至肝、肺等臟器顏色由鮮紅色變為白色時,改用4%多聚甲醛繼續灌注(Western blot檢材無需此步驟),觀察至大鼠四肢明顯抽搐現象,身體及全部臟器僵直生硬。將大鼠斷頭取材,沿矢狀縫剪開顱骨,暴露腦組織,取出全腦,浸泡于4%多聚甲醛,用于后續切片染色。Western blot檢材在冰上操作,剝離紋狀體腦區,切除小腦,沿矢狀縫將左右半球切開,從內側面慢慢剝離紋狀體(分離干凈白質),迅速轉移至-80℃備用。

1.4.7 尼氏染色 切片常規脫蠟復水,尼氏染料染色0.5～1 min,超純水漂洗,1%冰醋酸分化,鏡下觀察背景無色,尼氏小體染色明顯后停止分化,中性樹膠封片。

2 結果

2.1 METH對PC12細胞STC2,GRP78和CHOP mRNA和蛋白表達水平的影響qRT-PCR和Western blot結果顯示,與0 mM組比較,1.5 mM組、2 mM組、2.5 mM組細胞STC2、GRP78和CHOP的mRNA和蛋白表達水平顯著升高,且在2.5 mM組升高最顯著(P<0.01)(圖1)。

2.2 體外沉默STC2對METH誘導的PC12細胞ERS和凋亡相關蛋白表達水平的影響基于上述結果,選擇2.5 mM進行后續實驗。Western Blot結果顯示,與siRNA-NC組比較,siRNA-NC+METH組STC2、GRP78、CHOP、Bax、cleaved caspase12、cleaved caspase3的表達水平升高,同時Bcl-2表達水平下降(P<0.01);在沉默STC2后,與siRNA-NC+METH組比較,siRNA-STC2+METH組ERS凋亡相關蛋白GRP78、CHOP、Bax、cleaved caspase12、cleaved caspase3的表達水平進一步升高,同時Bcl-2的表達水平進一步下降(P<0.05)(圖2)。

注：A,各組STC2、GRP78、CHOP mRNA 相對表達水平;B,各組STC2、GRP78、CHOP 的Western blot圖;C,各組STC2、GRP78、CHOP蛋白相對表達水平;與0 mM組比較,*P<0.05, **P<0.01。

>注：A,不同siRNA處理后各組STC2蛋白Western blot圖;B,各組STC2蛋白相對表達水平;C,沉默STC2后各組STC2、GRP78、CHOP mRNA相對表達水平;D,沉默STC2后各組蛋白Western blot圖;E-F,各組蛋白相對表達水平;與siRNA-NC組比較, *P<0.05, **P<0.01; 與siRNA-NC+METH組比較, #P<0.05, ##P<0.01。

2.3 沉默STC2對METH誘導的PC12細胞凋亡的影響TUNEL實驗結果顯示,與siRNA-NC組比較,siRNA-NC+METH組TUNEL陽性細胞比例顯著增加(P<0.01)。沉默STC2后,與siRNA-NC+METH組比較,siRNA-STC2+METH組TUNEL陽性細胞比例進一步升高(P<0.01),流式細胞術也呈現相同的趨勢(圖3)。

2.4 體內沉默STC2對METH誘導的大鼠紋狀體神經元損傷的影響TUNEL實驗結果顯示,與siRNA-NC組比較,siRNA-NC+METH 組大鼠紋狀體神經元出現顯著凋亡(P<0.01);沉默STC2后,與siRNA-NC+METH組比較, siRNA-STC2+METH組TUNEL陽性細胞比例進一步上升(P<0.01)。尼氏染色結果顯示,與siRNA-NC組比較,siRNA-NC+METH組紋狀體內神經元排列不規則,胞內尼氏體減少,染色較淺;在沉默STC2后,METH對神經元的損傷進一步加重,尼氏體數量進一步降低,神經元排列更加紊亂(圖4)。

>注：A,各組細胞TUNEL染色圖(×200);B,TUNEL染色陽性細胞比例;C,各組細胞流式凋亡圖;D,各組細胞凋亡率;與siRNA-NC組比較, **P<0.01; 與siRNA-NC+METH組比較, ##P<0.01。

>注：A,各組紋狀體TUNEL染色圖(×200);B,TUNEL染色陽性細胞比例;C,各組紋狀體尼氏染色圖;與siRNA-NC組比較, **P<0.01; 與siRNA-NC+METH組比較, ##P<0.01。

2.5 體內沉默STC2對METH誘導的大鼠紋狀體ERS凋亡相關蛋白表達水平的影響Western blot結果顯示,與siRNA-NC組比較,siRNA-NC+METH組大鼠紋狀體內STC2、GRP78、CHOP、凋亡相關蛋白Bax、cleaved caspase12、cleaved caspase3表達水平顯著增加,抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平下降(P<0.01);沉默紋狀體內STC2表達后,ERS凋亡相關蛋白GRP78、CHOP、Bax、cleaved caspase12、cleaved caspase3的表達水平進一步升高,同時Bcl-2的表達水平進一步下降(P<0.05)(圖5)。

>注：A,各組蛋白Western blot圖; B-C,各組蛋白相對表達水平;與siRNA-NC組比較, **P<0.01; 與siRNA-NC+METH組比較, #P<0.05, ##P<0.01。

3 討論

METH誘導的神經毒性機制主要有氧化應激、興奮性毒性、神經炎癥等。作為一種分泌蛋白,STC2以自分泌或旁分泌的形式發揮作用[16]。有研究表明,METH會導致谷氨酸(Glutamic,Glu)積累,過量的Glu激活N-甲基-D-天冬氨酸受體和代謝性谷氨酸受體,引起Ca2+內流,使細胞內Ca2+濃度增加,過量的Ca2+激活一氧化氮合酶,促進一氧化氮的產生,導致 ERS和凋亡通路的激活[17]。基質相互作用分子1(Stromal interaction molecule 1, STIM1)表達于ER中,參與調節細胞內的Ca2+濃度。有研究表明,STC2與STIM1結合,限制STIM1介導的Ca2+內流,降低胞內Ca2+濃度[18],避免ERS的發生,保護細胞在應激下存活。METH可激活ERS,通過PERK-真核翻譯啟動因子2α(Eukaryotic translation initiation factor 2-alpha, eIF2α)-轉錄激活因子4(Activating transcription factor 4, ATF4)-CHOP途徑導致細胞凋亡[19],STC2可降低PERK的磷酸化,使eIF2α磷酸化降低,減少ATF4的表達,切斷該通路,減少ERS通路的凋亡[20]。STC2在缺氧[21]和葡萄糖缺乏[22]時均可保護細胞應對刺激,減輕ERS。作為缺氧誘導因子1(Hypoxia inducible factor-1, HIF-1)的靶點,STC2在缺氧時被上調,通過抑制Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白 1(Kelch-1ike ECH- associated protein l, Keap1)的表達,保護細胞在缺氧時免受損傷[21]。此外STC2在葡萄糖缺乏時,可促進糖酵解,補充能量原料[22]。METH引起的細胞凋亡十分復雜,涉及多種機制,可致細胞內產生大量的活性氧(Reactive oxygen species, ROS),引起氧化應激和線粒體功能障礙,導致胞內能量代謝異常,引發ERS。有研究顯示,STC2可直接作用于核因子紅細胞系2相關因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2),上調Nrf2的表達水平,激活下游信號通路,抑制ROS的產生,起到抗氧化的作用[23]。Wu等[24]的研究中,過表達STC2 激活磷酸化絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(Phosphorylated protein kinase, strain AK, Thymoma, pAKT)信號通路,促進細胞增殖,使細胞免受氧化應激引起的凋亡,進而緩解細胞功能紊亂,避免ERS的發生。

本研究發現METH誘導的神經細胞凋亡可由STC2調節,沉默STC2會促進METH誘導的神經細胞凋亡,提示STC2在METH誘導的神經細胞凋亡中起保護作用,且該保護作用是由ERS通路介導的。 CHOP作為一種轉錄因子,被多種應激條件所誘導,且在ERS凋亡通路中發揮重要作用[25]。CHOP可調控多種凋亡基因的表達,下調B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)和上調Bcl-2相關X蛋白(Bcl2-associated X, Bax)的表達水平,介導細胞凋亡[26]。本實驗結果顯示,METH的干預可上調PC12細胞和大鼠紋狀體中CHOP表達水平,增加Bax/Bcl-2的比率,啟動半胱氨酸天冬氨酸蛋白激酶(Caspase)級聯反應。在沉默STC2后,CHOP的表達水平進一步上調,同時細胞凋亡水平進一步加重,提示CHOP在METH誘導的凋亡中至關重要,但本實驗缺少通過沉默CHOP驗證其是否為STC2的下游靶分子。Caspase12是caspase蛋白家族中唯一參與ERS凋亡途徑的成員,活化的caspase12貫序激活caspase9、caspase3,啟動caspase家族經典凋亡途徑導致細胞凋亡的發生[27]。本實驗結果同樣顯示,沉默STC2后,METH引起的caspase12表達水平進一步上調,caspase3也進一步活化。值得注意的是,吸食者大腦中的METH峰值濃度可達0.1 mM,除ERS損傷機制外,METH還會引發免疫反應和高熱作用,進一步加劇其神經毒性作用[28]。因此,在體外模型中需給予較高劑量的濃度才能模擬體內的毒性效果,這也是本研究中采用1 mM-2.5 mM METH進行探究的原因。

綜上所述,本研究顯示沉默STC2的表達可促進METH引起ERS,加劇神經細胞凋亡,表明STC2在METH引起的神經細胞凋亡中發揮保護作用,有望為METH誘導的神經損傷提供新的治療策略和靶點。