高效液相色譜非衍生法檢測(cè)食用油中的黃曲霉毒素B1 的含量

◎ 黃良江

（來賓市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣西 來賓 546100）

黃曲霉毒素是一種生物毒素物質(zhì)，主要由黃曲霉、寄生曲霉、特曲霉等真菌曲霉次生代謝產(chǎn)生，具有很強(qiáng)的生物毒性和致癌性，是國際上公認(rèn)的一種具有強(qiáng)致癌性的物質(zhì)，WHO 將黃曲霉毒素劃定為一類致癌物。《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）對(duì)各類食品中允許的黃曲霉毒素含量進(jìn)行了規(guī)定，國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定玉米油、花生油中黃曲霉毒素B1的限量為不得超過20 μg·kg-1，植物油脂中黃曲霉毒素B1的限量為不得超過10 μg·kg-1。

目前文獻(xiàn)報(bào)道的測(cè)定黃曲霉毒素B1含量的檢測(cè)方法比較多，通常采用的方法有高效液相色譜衍生化法[1]、三重四極桿液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[2]和酶聯(lián)免疫法[3]。三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀由于價(jià)格高，很多實(shí)驗(yàn)室基于成本問題很難配備，液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)費(fèi)用也比較高，酶聯(lián)免疫法操作煩瑣。采用高效液相色譜法成本較低，操作方法比較簡單，但由于高效液相色譜法采用反相洗脫，會(huì)使黃曲霉毒素B1發(fā)生熒光效應(yīng)淬滅的問題，通常需要進(jìn)行衍生化以增強(qiáng)其熒光效應(yīng)，故國家標(biāo)準(zhǔn)和多數(shù)文獻(xiàn)[4-7]均采用衍生化法對(duì)黃曲霉毒素B1進(jìn)行含量測(cè)定。而采用衍生化檢測(cè)黃曲霉毒素B1的含量必須配備衍生器，增加了檢測(cè)成本。為改良和探索新的簡便、可靠、低成本的檢測(cè)方法，本實(shí)驗(yàn)探索建立高效液相色譜不連接衍生器直接測(cè)定黃曲霉毒素B1含量的新方法，為測(cè)定食用油中黃曲霉毒素B1的含量開發(fā)簡便、經(jīng)濟(jì)、可靠的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生油（批號(hào)SP001、SP002、SP003、SP004、SP005，購置于超市），黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品（1 mg，青島普瑞邦生物工程有限公司），乙腈、甲醇、乙醇（色譜純，德國默克公司），NaCl 試劑（分析純，上海滬試有限公司），免疫親和柱（3 mL，北京博爾西科技有限公司），實(shí)驗(yàn)用水均使用超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

e2695 高效液相色譜儀（沃特世）、2475 熒光檢測(cè)器、電子天平（梅特勒）、離心機(jī)（德國西格瑪）和磁力攪拌器（德國海道夫）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱類型和規(guī)格：C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A 相（V乙腈∶V甲醇=50 ∶50）∶B相（水）=35 ∶65；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：40 ℃；檢測(cè)器波長：熒光激發(fā)波長366 nm，發(fā)射波長436 nm；洗脫方式：等度洗脫。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

稱取黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品1 mg（精確至0.01 mg），用乙腈進(jìn)行溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL 的容量瓶，用乙腈定容至刻度，配制成10 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液（1 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)液）。準(zhǔn)確移取1 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)液1 mL 于50 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，配制成200 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液（2 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)液）。準(zhǔn)確移取2 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)液100 μL于20 mL 容量瓶，用初始流動(dòng)相定容至刻度，配制成濃度為1.0 ng·mL-1標(biāo)準(zhǔn)工作液（3 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)液）。同理，用2 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)液配制出濃度為5.0 ng·mL-1（4 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)液）、15.0 ng·mL-1（5 號(hào) 標(biāo) 準(zhǔn) 液）、30.0 ng·mL-1（6 號(hào) 標(biāo)準(zhǔn)液）、50.0 ng·mL-1（7 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)液）的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.3 樣品溶液的制備

取花生油樣品適量，稱取樣品約5 g，準(zhǔn)確稱量，置于250 mL 錐形瓶，稱取NaCl 試劑3 g 加入錐形瓶中，再準(zhǔn)確量取75 mL 濃度為70%甲醇溶液倒入錐形瓶，以20 000 r·min-1的攪拌速度高速攪拌樣品3 min，再將攪拌后的樣品轉(zhuǎn)移至離心管中，以5 000 r·min-1的速度高速離心10 min，精密移取離心后的上清液15 mL，置于50 mL 容量瓶中，用水稀釋至刻度并搖勻，將搖勻后的上清液轉(zhuǎn)移至離心管，再以5 000 r·min-1的速度離心10 min，離心后再精密吸取上清液20 mL，注入免疫親和柱進(jìn)行分離，過柱流速為1 mL·min-1，待過柱完成后用20 mL 蒸餾水進(jìn)行洗脫，讓空氣完全進(jìn)入免疫親和柱中，將水?dāng)D出柱子，棄去洗脫液，再用適量色譜甲醇進(jìn)行洗脫，用2 mL 容量瓶收集洗脫下來的洗脫液，用色譜甲醇定容至刻度，充分搖勻后用0.22 μm 的微孔濾膜過濾，接取濾液于進(jìn)樣瓶中，待上機(jī)用。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜圖

將空白溶劑、樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別進(jìn)樣，非衍生法分析條件下，空白試劑不干擾黃曲霉毒素B1的檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液色譜圖如圖1、圖2所示。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性范圍

取黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品適量，分別配制成濃度為1.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、15.0 ng·mL-1、30.0 ng·mL-1和50.0 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，縱坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品積分出的峰面積，繪制濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線。黃曲霉毒素B1的線性方程為Y=94 862.08X-18 268.81，相關(guān)系數(shù)r=0.999 997，黃曲霉毒素B1在1.0 ～50.0 ng·mL-1線性良好。

2.2.2 檢出限和定量限

依據(jù)國標(biāo)GB 5009.22—2016，當(dāng)稱取樣品5 g 時(shí)，黃曲霉毒素B1的檢出限和定量限分別為0.03 μg·kg-1、0.1 μg·kg-1，檢出限和定量限換算為濃度單位分別為0.075 ng·mL-1、0.25 ng·mL-1。本實(shí)驗(yàn)分別以3 倍信噪比和10 倍信噪比作為方法檢出限和定量限，將低濃度對(duì)照品逐級(jí)稀釋后進(jìn)樣分析，當(dāng)信噪比（S/N）約為3.0 時(shí)測(cè) 得 方法檢 出 限為0.03 ng·mL-1，當(dāng)S/N 約為10.0 時(shí)測(cè)得方法定量限為0.1 ng·mL-1。本方法測(cè)得的方法檢出限和方法定量限均小于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢出限和定量限，實(shí)驗(yàn)表明本方法的靈敏度能滿足要求。

2.2.3 精密度

取 濃 度 為5.0 ng·mL-1的 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液 以20 μL 進(jìn)樣量連續(xù)6 針重復(fù)進(jìn)樣，考察儀器的精密度。6 次進(jìn)樣的保留時(shí)間分別為32.015 min、32.011 min、32.013 min、32.003 min、32.008 min 和32.012 min，保留時(shí)間RSD 為0.01%，峰面積分別為461 021、461 333、460 838、460 998、461 003、461 219，峰 面積RSD 為0.04%，保留時(shí)間RSD ＜0.2%，峰面積RSD ＜2.0%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 加標(biāo)回收率

稱取已測(cè)知含量的花生油樣品約5 g，精密稱定。分別精密加入黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品50 ng、75 ng、250 ng，按照1.3.3 項(xiàng)下的制備方法制備低、中、高3 種濃度的樣品溶液共9 份，每份樣品以20 μL 進(jìn)樣注入高效液相色譜測(cè)定黃曲霉毒素B1的含量，計(jì)算每份樣品的加標(biāo)回收率。實(shí)驗(yàn)測(cè)得低、中、高3 種添加水平的樣品的平均加標(biāo)回收率分別為98.3%、101.5%、99.4%，加標(biāo)回收率在標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的70%～125%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見表1。

表1 3 種添加水平下加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果表

2.3 樣品測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)對(duì)批號(hào)為SP001、SP002、SP003、SP004和SP005 的5 批次樣品分別采用非衍生法和柱后衍生法進(jìn)行對(duì)比測(cè)定，結(jié)果如表2 所示。取樣品溶液進(jìn)樣20 μL，兩種方法測(cè)定時(shí)，SP001、SP002、SP003、SP004 樣品均未檢出黃曲霉毒素B1，SP005 樣品非衍生法測(cè)得含量為10.63 μg·kg-1，柱后衍生法測(cè)得含量為10.98 μg·kg-1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.24%，兩種方法檢測(cè)結(jié)果沒有顯著差異。5 批次食用油樣品中黃曲霉毒素B1的含量均符合國家標(biāo)準(zhǔn)中該產(chǎn)品項(xiàng)下對(duì)黃曲霉毒素B1的限量要求，即黃曲霉毒素B1不大于20 μg·kg-1。

表2 5 批次樣品黃曲霉毒素B1 測(cè)定結(jié)果表

3 結(jié)論

本研究采用高效液相色譜非衍生化方法對(duì)食用油樣品中的黃曲霉毒素B1含量進(jìn)行分析檢測(cè)，探索樣品經(jīng)過免疫親和柱凈化處理后，采用高效液相色譜非衍生化方法對(duì)食用油進(jìn)行黃曲霉毒素B1含量檢測(cè)的可行性。通過方法學(xué)考察了該方法的檢出限、定量限、線性范圍、精密度和加標(biāo)回收率，并對(duì)食用油進(jìn)行了實(shí)際樣品的檢測(cè)分析，結(jié)果表明該方法的檢出限、定量限、靈敏度均滿足黃曲霉毒素B1含量測(cè)定的要求，可以用于食用油中黃曲霉毒素B1含量的檢測(cè)。該方法簡便、經(jīng)濟(jì)、可靠，可作為食用油中黃曲霉毒素B1含量檢測(cè)的參考方法。