PCR-反向斑點雜交技術在即食果蔬常見致病微生物快速篩查中的應用

◎ 楊丹妮，鄒雨虹

（常州市食品藥品纖維質量監督檢驗中心，江蘇 常州 213000）

水果蔬菜中富含人體必需的維生素、有機酸、無機鹽和植物纖維等營養成分，而即食生鮮果蔬食品因食用方便、口味清新和味道鮮美，更是人們日常生活中和餐桌上常見的食物。但是，生鮮果蔬食品僅經簡單清洗，未經高溫殺菌處理，其表面和內部附著的微生物對其食用安全性造成了極大的隱患[1-2]。因此，如何做好即食生鮮果蔬中病原性微生物檢測成為食品安全領域關注的一個重要課題。

目前即食生鮮果蔬中致病菌檢測的方法主要有分離培養[3]、生化鑒定[4]、酶聯免疫吸附[5]、聚合酶鏈式反應[6]和基因芯片法[7]等。常規方法費時費力，既增加了企業的成本，也加大了政府對于食品安全的監管難度，還無法滿足致病病毒和細菌的同時檢測。熒光定量PCR 法在一定程度上彌補了傳統方法的部分不足，但受其熒光通道的限制，在樣本量大、檢測指標多的情況下，大大增加工作量。因此，急需一種操作簡單、結果直觀、單次反應可滿足多指標篩檢要求的方法來對即食果蔬中的多種致病微生物進行同時篩檢。

膜芯片法利用反向斑點雜交技術（Reverse Dot Blot Hybridization，RDBH）將待測靶標基因中的特異性序列作為探針固定在尼龍膜上，同時利用多對帶生物素標記的引物對待測靶標基因進行擴增，通過酶-底物顯色，產生肉眼可辨的信號，具有快速、簡便、高效、直觀等特點。同時結合多重PCR 技術，雙重反應體系確保檢測結果的準確性，單次反應可同時篩檢數十種指標[8]。本研究擬在PCR-膜芯片技術的基礎上，建立包括沙門氏菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸埃希氏菌O157:H7（Escherichia coliO157:H7）、單核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、輪狀病毒（Rotavirus，RV）、諾如病毒（Norovirus，NV）GI 型和GII 型在內的7 種食源性致病微生物的快速篩查方法。

1 材料與方法

1.1 樣品、標準菌及病毒樣本

市場樣品共14份，均購自常州市各大流通環節市場。

沙門氏菌（21513）、大腸埃希氏菌O157:H7（21530）、金黃色葡萄球菌（10384）、單核增生李斯特氏菌（21633）、阪崎腸桿菌（21544）、志賀氏菌（21535）、霍亂弧菌（23794）、副溶血性弧菌（21617）、蠟樣芽孢桿菌（21261）和創傷弧菌（21615）等均購自中國工業微生物菌種保藏管理中心。輪狀病毒（BDS-IQC-072）、諾如病毒（BDS-IQC-226）核酸質控品購自廣州邦德盛生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

細菌基因組DNA 提取試劑盒（DP302）、病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒（DP315）購自天根生化科技（北京）有限公司；膜芯片檢測試劑盒，由四川華漢三創生物科技有限公司提供；PCR 引物及探針，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并純化。

1.3 實驗方法

1.3.1 PCR 引物及探針設計

根據所查文獻、生物信息學分析并結合實驗測試結果，最終選取了具體對應的特異性基因，詳細信息見表1。

表1 多重PCR 引物、探針信息表

1.3.2 樣品處理與DNA 提取

無菌條件下迅速稱取待檢樣品20 g，并平均分為等質量的兩份（每份10 g）。

（1）細菌前增菌。取待檢樣品加入100 mL 共增菌培養基中。在恒溫振蕩培養箱中35 ℃、150 r·min-1培養24 h后取出培養基，靜置3～5 min后，取1～3 mL增菌液至一滅菌EP 管中，12 000 r·min-1離心2 min，棄上清留沉淀進行細菌基因組DNA 提取。

（2）病毒富集。參考GB 4789.42—2016 軟質水果和生食蔬菜中諾如病毒富集方法進行病毒的富集，并用于病毒RNA 提取。

（3）細菌、病毒基因組DNA/RNA 提取及質量測定。進行細菌、病毒基因組DNA/RNA 提取，提取后的基因組DNA 用Nanodrop 2000 測定質量，一般要求核酸濃度在20 ng·μL-1以上，A260/A280介于1.8 ～2.0。

1.3.3 PCR 擴增

以待測樣品DNA 為模板，依次加入多重PCR Buffer10 μL、EnzymeMix 0.45 μL、Hela cell total RNA 1 μL、樣品總核酸2 ～5 μL，最后用ddH2O 補足20 μL體系。

PCR 擴增程序：反轉錄45 ℃，30 min；95 ℃，2 min；95 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，30 s，35 cycles；72 ℃延伸5 min；12 ℃保溫。擴增結束后，即可得到多重PCR 產物。

1.3.4 膜芯片制備

將尼龍膜裁成1.1 cm×1.1 cm 的膜條，放置于雙蒸水中浸泡15 min，用15×SSC 浸泡15 min，取出后放在濾紙上80 ℃烘干，待膜條降至室溫后，按膜芯片探針布局圖（圖1）上順序依次點上內參探針（10 ～20 μmol·L-1）、各檢測靶標探針（10 ～20 μmol·L-1）、陽性探針PC（5 μmol·L-1）以及陰性探針NC（5 μmol·L-1）。

圖1 膜芯片探針布局圖

1.3.5 雜交顯色將多重PCR 產物置于95 ℃加熱5 min 使其解鏈，立即取出低溫放置，完成雜交反應。

1.3.6 結果判讀

雜交反應結束后，對照膜芯片點陣圖判讀檢測結果，膜芯片探針布局圖如圖1 所示。結果有效前提：芯片上陽性質控點（Positive）顯色，陰性質控點（Negative）不顯色。

2 結果與分析

2.1 特異性測試

陽性模板取1.1 中所述的7 種陽性樣本，按照1.3進行實驗操作，檢測體系特異性。檢測結果如圖2所示，各陽性核酸檢測結果靶標點單一且特異，各陰性核酸無陽性探針點顯色，充分證明了該體系具有良好的特異性。

圖2 膜芯片特異性測試芯片結果圖

2.2 檢出限測試

采 用1.1 中 的7 種 濃 度 為1.0×107copies/mL 的陽性樣本再進行2 個梯度稀釋后檢測多重體系的檢測限，各梯度核酸加樣量為2 μL。如圖3 ～4 所示，通過肉眼觀察結合儀器信號值判斷，結果表明使用陽性樣本進行檢測，綜合檢測限可達1.0×105copies/mL。檢出限以上的樣本，包括混合樣本均能檢測到所有陽性靶點。

圖3 1.0×106 copies/mL 陽性樣本測試結果圖

圖4 1.0×105 copies/mL 陽性樣本測試結果圖

2.3 樣本測試

2.3.1 市場樣本測試

收集市場上各種即食蔬菜、水果等，提取相應樣本中的核酸，使用已建立的多重PCR 檢測體系進行測試，驗證體系的可應用性。檢測結果如圖5 所示。

圖5 樣本應用性評價測試結果圖

2.3.2 模擬檢測

選取鮮切蘋果作為樣品采用人工添加標準樣品的形式進行模擬檢測實驗，驗證體系的可應用性。取沙門氏菌、大腸埃希氏菌O157、金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌劃線平皿上的單菌落，接種至液體培養基中培養過夜，梯度稀釋至10-7～10-8（約稀釋至1 000 CFU·mL-1），分別取100 μL 接種至100 mL 共增菌培養基中。病毒核酸質控品：向病毒富集體系中加入臨界濃度的病毒質控品樣本。后續同上述樣本處理步驟，檢測結果如圖6 所示，結果均與預期相符，證明了體系具有良好的可應用性。

圖6 模擬檢測結果芯片圖

3 結論

水果蔬菜作為健康飲食的重要組成部分，其消費量逐年上升[9]。近年來，即食果蔬食品越來越受消費者的青睞。即食果蔬在食用前會經過清洗、消毒、切割、分裝等諸多加工處理環節，容易發生微生物污染。全世界范圍內由即食果蔬致病微生物引起的食源性疾病事件頻發[10-11]。本研究通過對膜芯片體系檢測特異性和檢出限的測試，充分說明該技術具有穩定性高、特異性強、靈敏度高的特點。既提高了檢測通量，也提高了檢測效率，為食品安全預防監控、風險評估等提供了一種新型、快速、有效的檢測手段。