食品中牛、羊、豬、馬源性成分檢測能力驗證結果與分析

◎ 蘇妙貞，楊丹婷，丁清龍，周 露

（廣東省食品檢驗所，廣東 廣州 510435）

肉類是動物的皮下組織及肌肉，肉類食品含有豐富的蛋白質，通常是人們飲食中的重要組成部分[1]。近年，社會接連出現肉類食品摻假或以次充好的問題，如2013 年歐洲的“馬肉風波”，在多款冷凍牛肉食品中檢出馬肉成分[2]。另外，還有個別不法商人低價購入豬肉摻入價格更高的牛肉[3]或羊肉中、將低價風干鴨肉干冒充為牦牛干等。為保障消費者的利益及食品質量安全，動物源性成分檢測具有重要的社會意義。

中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心（ACAS）是中國合格評定國家認可委員會認可的能力驗證提供者，能對參加者的結果進行評價[4]。能力驗證是檢驗實驗室能力的重要手段之一，參加能力驗證對于持續提高實驗室檢測水平和質量控制具有重要意義。本實驗室于2022 年5 月參加了ACAS 組織的食品中牛、羊、豬、馬源性成分檢測能力驗證ACAS-PT1397（2022）。選用SN/T 2051—2008[5]進行牛、羊源性成分檢測；SN/T 3730.5—2013[6]進行馬源性成分檢測；SN/T 3730.8—2013[7]進行豬源性成分檢測，并用BJS 201904[8]對豬源性成分檢測結果再確認。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2 個樣品由ACAS 提供，為肉類產品，呈肉糜狀，鋁箔袋真空包裝，重約10 g，編號為22-K950、22-W704；陰性樣品為市場購買的雞肉樣品；陽性樣品為市場購買的牛肉、羊肉、豬肉、馬肉樣品；實驗用水為無菌ddH2O。

1.2 儀器與試劑

ME203 天平（美國梅特勒-托利多科技有限公司）；AB2-3S1 生物安全柜（新加坡ESCO 公司）；Nano 核酸蛋白分析儀（日本島津企業管理有限公司）；CFX-96 實時熒光PCR 儀（美國伯樂公司）；Quant Studio 6 Flex 實時熒光PCR 儀（美國賽默飛世爾科技公司）；Centrifuge 5430 離心機（德國艾本德公司）

DNA 提 取 試 劑 盒（ 德 國QIAGEN 公 司）；Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）（ 日 本TaKaRa 公司）；Real Time PCR Bovine DNA Detection Kit（日本TaKaRa 公司）；Real Time PCR Ovine DNA Detection Kit（日本TaKaRa 公司）；內參照、豬源性成分的正向引物、反向引物、探針按照SN/T 3730.8—2013 和BJS 201904，馬源性成分的正向引物、反向引物、探針按照SN/T 3730.5—2013 提供的序列信息由生工生物工程上海股份有限公司合成。

1.3 實驗方法

參照組織方提供的參試指導書、SN/T 2051—2008、SN/T 3730.8—2013、SN/T 3730.5—2013 和BJS 201904進行實驗。

1.3.1 樣品DNA 提取

分別取樣品約200 mg，取樣盡量均勻。根據DNA 提取試劑盒說明書步驟提取樣品DNA，每個樣品提取3 個平行樣。提取過程同時取200 μL 水作為提取空白對照，與樣品同時進行DNA 提取。用核酸蛋白分析儀測定DNA 濃度、A260及A280的比值，將DNA 濃度統一用水稀釋至50 ng·μL-1進行后續實驗。

1.3.2 牛、羊源性成分PCR 擴增

用CFX-96 實時熒光PCR 儀，按照SN/T 2051—2008 進行牛、羊源性成分檢測。反應體系：總體積為25 μL，其中包括2×premix 12.5 μL，引物（10 μmol·L-1）混合 液1 μL，探 針（10 μmol·L-1）1 μL，模 板DNA 2 μL，水8.5 μL。反應條件：95 ℃預變性10 s，1 個循環；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，40 個循環，在每次循環的退火時收集熒光。

1.3.3 豬源性成分PCR 擴增

用Quant Studio 6 Flex 實時熒光PCR 儀，先按照SN/T 3730.8—2013 進行豬源性成分檢測。反應體系：總體積為25 μL，其中包括2×premix 12.5 μL，引物（10 μmol·L-1）各1 μL，探 針（10 μmol·L-1）1 μL，模板DNA 2 μL，水7.5 μL。反應條件：50 ℃預變性2 min，95 ℃預變性10 min，1 個循環；95 ℃變性15 s，58 ℃退火延伸1 min，45 個循環，在每次循環的退火時收集熒光。

對需要再確認的樣品，用Quant Studio 6 Flex 實時熒光PCR 儀按照BJS 201904 進行豬源性成分檢測。反應體系：總體積為20 μL，其中包括2×premix 10 μL，引物（10 μmol·L-1）各0.2 μL，探針（10 μmol·L-1）0.1 μL，模板DNA 1 μL，水8.5 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min，1 個循環；95 ℃變性15 s，58 ℃退火延伸1 min，35 個循環，在每次循環的退火時收集熒光。

1.3.4 馬源性成分PCR 擴增

用CFX-96 實時熒光PCR 儀，按照SN/T 3730.5—2013 進行馬源性成分檢測。反應體系：總體積為25 μL，其中包括2×premix 12.5 μL，引物（10 μmol·L-1）各1 μL，探針（10 μmol·L-1）1 μL，模板DNA 2 μL，水7.5 μL。反應條件：94 ℃預變性1 min，1 個循環；94 ℃變性34 s，60 ℃退火延伸45 s，40 個循環，在每次循環的退火時收集熒光。

1.3.5 質量控制

每個實驗過程均設置陽性對照、陰性對照、試劑空白對照及提取空白對照。試劑空白對照即用水代替模板；提取空白對照即在樣品DNA 提取過程中，用水代替樣品與樣品同時進行DNA 提取；熒光PCR 實驗的每個樣品各加2 個平行孔。結果根據SN/T 2051—2008、SN/T 3730.8—2013、SN/T 3730.5—2013、BJS 201904 要求進行判定。

2 結果與分析

2 個樣品各提取3 個平行樣的A260和A280比值均在1.8 ～2.0，說明DNA 濃度較高，提取效果較好[9]。在豬源性成分PCR 擴增實驗中，按照SN/T 3730.8—2013 要求做的樣品內參照（18S rRNA 基因）均有熒光對數增長，且熒光通道出現典型的擴增曲線，Ct 值均＜30，證明有提取到動物源性DNA，符合實驗要求。

本次實驗設置的陽性對照、陰性對照、試劑空白對照及提取空白對照均符合要求，實驗結果有效。兩個樣品的牛、羊、豬、馬成分檢測結果根據相應檢測標準判定。各樣品的檢測結果詳見表1。

表1 各樣品的檢測結果表

樣品22-W704 的3 個平行樣的4 個檢測檢測項目結果基本一致，可得出相同結論。樣品22-K950 的3個平行樣品的牛、羊、馬源性成分結果也基本一致，可得出相同結論。用SN/T 3730.8—2013 檢測的豬源性成分判定結果出現不一致的情況：兩份樣品未檢出豬源性成分，一份樣品檢出豬源性成分但Ct 值（36.951、39.309）較大。將相同3 個平行樣用BJS 201904 進行實驗，按BJS 201904 檢驗和判定均未檢出豬源性成分（表2），增強了22-K950 的豬源性成分檢測結果為未檢出的信心。

表2 22-K950 豬源性成分用BJS 201904 檢測結果表

最終結果為樣品22-K950 檢出羊源性成分，未檢出牛、豬、馬成分；樣品22-W704 檢出牛、羊、豬源性成分，未檢出馬源性成分（表3）。

表3 能力驗證上報結果表

3 結論與討論

將最終實驗結果上報至ACAS，結果均為滿意。證明本實驗室有能力進行動物源性成分的檢測，也是對本實驗室的充分肯定。本次能力驗證，開闊了檢測人員的思路并積累了經驗，促進了本實驗室能力的提升。

本實驗用了兩種方法確認樣品22-K950 的豬源性成分檢測結果。方法比較能提高結果準確性和檢測能力，為實驗室能力驗證結果填報提供了參考，提高實驗室報出結果的把握[10]。根據經驗，在結果判定時，需結合Ct 值和擴增曲線進行綜合判定[11]。分析本實驗樣品22-K950 用SN/T 3730.8—2013 檢測，有一份Ct 值（36.951、39.309）較大的情況，其擴增曲線并不十分典型，考慮為假陽性。結合BJS 201904 判定結果，得出該樣品未檢出豬源性成分的結論。對該樣品，雖然BJS 201904 的Ct 值大于35 判定未檢出，仍未達到SN/T 3730.8—2013 檢測的Ct 值36.951 和39.309，但用SN/T 3730.8—2013 檢測豬源性成分上報結果為未檢出的能力驗證結果評價為滿意，則說明SN/T 3730.8—2013 和BJS 201904 得出的未檢出豬源性成分實驗結果均可靠。

熒光PCR 結果出現假陽性的可能原因有實驗耗材污染、陽性樣本和陽性對照造成的污染[12]、樣品制作過程環境交叉污染等。由于本實驗的空白對照、提取對照結果均符合要求，則認為本實驗豬源性成分檢測所出現的情況很可能是樣品在制樣過程交叉污染導致的。

熒光PCR 技術有靈敏度高、特異性強的特點，廣泛應用于肉制品中物質的定性和定量分析[13]。由于該技術的極高敏感性，樣品采集、提取過程的污染及環境氣溶膠污染容易導致結果假陽性。為預防以上情況出現，實驗室應區分試劑準備區、核酸提取區、產物擴增區、產物分析區；實驗人員應嚴格按照檢測方法操作；使用的耗材如PCR 管應無菌無酶等[14]。對肉類檢測，基于DNA 生物學層面的分析技術除了熒光PCR 法外，還有常規PCR、數字PCR、等溫擴增檢測技術、DNA 條形碼和下一代測序等技術[15]。