陳舊骸骨DNA身份鑒定的法醫(yī)學進展

陳璐，周喆，王升啟

軍事醫(yī)學研究院生物信息中心，北京 100850

牙齒和骨骼組織由于結(jié)構(gòu)特殊而具有很強的抗腐敗能力，在許多復雜案例中，如歷史人物鑒定、失蹤人員調(diào)查、重大災難處理、戰(zhàn)爭遺骸鑒定等，往往是可用于DNA 分析的唯一生物檢材[1-3]。牙齒和骨骼中含有大量無機成分，起到長久保存DNA 的作用，即使檢材白骨化或者被破壞，仍可提供DNA 用于檢測。同時，這些無機成分使得牙齒和骨骼類樣本需要特殊的預處理和提取方法釋放和回收DNA。通常情況下，牙齒和骨骼檢材的DNA 鑒定步驟包括取材和研磨，脫鈣和裂解，DNA 純化和定量，擴增和片段分析。然而，在實際檢案中，死后間隔數(shù)年至數(shù)十年的骨骼和牙齒在被發(fā)掘前，可能已長久暴露在外界復雜的環(huán)境中，鑒定人員面臨陳舊骸骨DNA 含量極少、高度降解、嚴重污染、抑制因素干擾等嚴峻挑戰(zhàn)[4-5]。本文綜合了近年來的相關(guān)研究成果和案例報道，從采集檢材、DNA 提取、DNA 富集和檢測分析方案等方面進行綜述，為法醫(yī)學陳舊骸骨DNA 研究和鑒定、法醫(yī)考古分子研究、人類學分子研究等提供參考。

1 骨骼選材

根據(jù)國際法醫(yī)遺傳學會（International Society for Forensic Genetics，ISFG）的DNA 委員會針對災難遇害者身份鑒定的建議[4]，對于跨越數(shù)周或更長時間的樣本收集或在不利的環(huán)境條件下，骨骼和牙齒樣本是最可靠的DNA 來源。骨骼和牙齒是自然狀態(tài)下保留時間最久的生物樣本，法醫(yī)學現(xiàn)場勘驗員應根據(jù)現(xiàn)場條件判斷和選取可以提供更多遺傳信息的檢材。牙齒是人體內(nèi)最堅硬的組織之一，完整的牙齒樣本封閉性強，微生物群影響低，利于DNA 保存。牙齒選材一般原則為選擇非離體、封閉、完整的磨牙[6]。人體共計206 塊骨骼，這些骨骼在個體間、不同類型間、同一類型不同部位間DNA 含量和抗降解能力均存在差異[7]。一般情況下，選材以承重部位長骨的致密皮質(zhì)骨為首選，松質(zhì)骨可能也含有豐富的DNA，但抗降解能力差，保存DNA 能力有限[4]。

近20 年來，首選長骨作為陳舊骨骼身份鑒定的DNA來源已經(jīng)成為法醫(yī)學領(lǐng)域的共識[7-8]。美國武裝部隊DNA 鑒定實驗室（Armed Forces DNA Identification Laboratory，AFDIL）于1994—2004 年處理了約2 000 份二戰(zhàn)期間、越南戰(zhàn)爭期間人類骸骨和牙齒樣本，結(jié)果顯示，承重的長骨（如股骨、脛骨、跖骨）是最好的標本類型，尤其長骨皮質(zhì)最密集的部分效果最佳。松質(zhì)骨常因暴露在環(huán)境中受到破損和污染，孔隙難以徹底清理，DNA 提取效果不如致密的皮質(zhì)骨[8]。研究人員比較了股骨和脛骨5 個解剖位置的DNA 回收情況和STR 圖譜，包含近端干骺端、近端骨干、骨干中段、遠端骨干和遠端干骺端，結(jié)果顯示，股骨的DNA 回收率明顯高于脛骨，其中股骨中段和遠端骨干可得到完整的STR 圖譜[9]。一些死后間隔時間較短的骨骼鑒定意見支持首選松質(zhì)骨[7,10]。MUNDORFF 等[10]從3 具白骨化的骸骨中提取55 個骨骼部位的DNA，比較單個個體骨骼樣本不同位置的DNA 產(chǎn)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小的松質(zhì)骨平均每單位質(zhì)量骨粉產(chǎn)生的DNA 數(shù)量比致密的皮質(zhì)骨高得多，該結(jié)果在另外10 例骨骼樣本中也得到支持，該研究所用樣本為死后3～21 年骸骨。另一項對死后間隔4 年的49 例不同類型骨骼的研究[7]結(jié)果表明，足部的小型松質(zhì)骨優(yōu)于其他類型，認為這可能是由于骨骺線間的軟組織殘留物在細菌所形成的生物膜下保存良好，使得DNA 未被降解[2]。綜合文獻，當僅考慮死后間隔時間時，如死后間隔大于50 年，首選長骨的骨皮質(zhì)回收DNA，如死后間隔小于20 年，松質(zhì)骨更佳。

隨著各類疑難案例中陳舊骨骼樣本鑒定需求的增加，陳舊骨骼DNA 高度降解、嚴重污染成為DNA 檢測的最大挑戰(zhàn)。借鑒古人類DNA 研究，人類顳骨巖部作為鑒定檢材逐漸被法醫(yī)學界引入和嘗試[2,11-14]。顳骨巖部位于顱底蝶骨和枕骨之間，是哺乳動物體內(nèi)最硬和最致密的骨骼[15]。2014年，GAMBA 等[16]分析了13例意大利考古遺址挖掘的遺骸（從公元前5700年到公元前800 年）中顳骨巖部、牙本質(zhì)、股骨、肋骨、掌骨和跖骨的內(nèi)源性DNA 產(chǎn)量，結(jié)果顯示，顳骨巖部DNA產(chǎn)量最高，更適合降解樣本，認為這可能與高密度顳骨巖部導致細菌介導的DNA 減少有關(guān)[17]。PINHASI等[18]進一步比較了顳骨巖部3個區(qū)域的內(nèi)源性DNA 產(chǎn)量，即小梁骨的海綿部分、環(huán)繞骨質(zhì)內(nèi)耳的皮質(zhì)骨致密部分和耳囊內(nèi)致密部分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，耳囊內(nèi)DNA數(shù)量為環(huán)繞骨質(zhì)內(nèi)耳的皮質(zhì)骨致密部分的65倍，為小梁骨海綿部分的177倍。最近，有研究[2]分析了3具完整的第二次世界大戰(zhàn)期間骸骨，得到了相同結(jié)果，即所有骨骼中顳骨巖部耳囊內(nèi)致密部位的DNA 產(chǎn)量較高。該研究團隊還認為，第三掌骨和跖骨DNA 回收效果良好，取樣簡單，減少了潛在的DNA 污染，在發(fā)掘的骸骨樣本較完整時可以采用[13]。當生物檢材極難獲取時，除上述骨骼類型外，第一肋骨近端或椎體末端[19]，第12 胸椎的板層和棘突處[20]，腳部楔形骨、遠端腳趾骨、距骨[21]等也被證實可用于骸骨DNA 鑒定，而顱骨碎片可能最難獲得有效序列數(shù)據(jù)[8]。

綜上所述，陳舊骸骨檢材選取股骨、脛骨承重骨的皮質(zhì)部位提取DNA 效果最佳，并且方便識別、保存和運輸。在有完整顱骨檢材時，采集顳骨巖部也是值得推薦的選擇。當以上骨骼部位均不可采集時，椎骨、距骨、掌骨等均有采集價值。

2 DNA 準備

2.1 DNA 提取

人類骨骼組織主要由骨細胞、成骨細胞和破骨細胞組成，其細胞間質(zhì)主要由膠原和羥基磷灰石構(gòu)成，膠原約占骨質(zhì)量的30%，羥基磷灰石約占骨干質(zhì)量的65%～75%[22]。因此，骨組織抗腐敗降解能力強但同時高度鈣化增加了骨組織DNA 的回收難度。理想的骸骨DNA 提取效果是消耗少量骨粉獲得高質(zhì)量DNA。因此，DNA 提取過程應盡量減少和簡化提取步驟，以避免DNA 的進一步降解和污染，從而實現(xiàn)DNA 提取快速、高效、簡便、純凈。傳統(tǒng)的骨骼、牙齒DNA 提取方法主要分為去礦物質(zhì)、裂解和純化三步。去礦物質(zhì)又稱脫鈣，其基于一個前提，即DNA 被緊密地結(jié)合在密集的骨結(jié)晶聚合體中，沒有脫鈣處理，DNA 就不會被釋放到溶液中[23]。樣本脫鈣后，利用蛋白酶K 裂解細胞釋放DNA，最后以過濾柱[8,24]、磁珠[25-26]純化回收DNA。

經(jīng)典的骨骼DNA 提取方案[8]為向1～2 g 骨粉中加入3 mL 提取液[10 mmol/L Tris，pH=8.0；100 mmol/L NaCl，50 mmol/L 乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetra-acetic acid，EDTA），pH=8.0；0.5%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）]和100 μL 20 mg/mL蛋白酶K，充分混勻后56 ℃輕輕振蕩過夜。次日，利用有機溶劑（V苯酚：V氯仿：V異戊醇=25∶24∶1）進行DNA 純化和濃縮。但此方法不能完全去除礦物質(zhì)，即非完全脫鈣法，且其孵育過程中需要更換脫鈣液或脫鈣后移取上清液，增加了操作步驟且易損失DNA。因此，LOREILLE 等[27]提出完全脫鈣法，即每克骨粉中加入15 mL 提取液（0.5 mol/L EDTA 和1%月桂醇-肌氨酸鈉）和200 μL 20 mg/mL 蛋白酶K，至骨粉完全物理溶解后采用有機試劑法回收DNA。該方法較非完全脫鈣法的DNA 提取率平均提高約4.6 倍[28]。SEO 等[24]利用上述DNA 提取方法，通過比較2 mL 和9 mL 的脫鈣液，結(jié)果同樣支持完全脫鈣處理能夠回收更多DNA。董慧婷等[29]比較了不同濃度EDTA 脫鈣液對骨骼DNA的提取效率，結(jié)果表明，0.5 mol/L EDTA 在3～24 h內(nèi)效率均最高。研究[24]發(fā)現(xiàn)，QIAquick?離心柱不僅回收更多DNA，并且含PCR 抑制物少，STR 分型效果更好。Qiagen MinElute 柱提法試劑盒作為一種骨骼DNA 純化方案，旨在回收高質(zhì)量DNA 的同時，降低脫鈣液中抑制劑的干擾。但有研究[30]報道，Qiagen MinElute 柱提取DNA 損失率為21.75%～60.56%，且不擅長回收較小片段。

近年骨骼和牙齒DNA 提取方案在快速、高效方面也取得了進步。LIU 等[31]提出了一種簡便快速的有機試劑提取和磁珠回收骨骼DNA 方案，該方案在6 h內(nèi)可以完成1 g 陳舊骨粉DNA 提取，大大縮短了骨骼DNA 的提取時間。美國Promega 公司新研制的骨骼脫鈣緩沖液可在4 h 內(nèi)成功提取25 mg 新鮮骨粉DNA，如果配合自動DNA IQTM工作流程將提高提取效率[31]。PrepFilerTMBTA 法醫(yī)DNA 提取試劑盒是美國Applied Biosystems 公司專門為處理具有挑戰(zhàn)性的法醫(yī)學樣本（如骨頭、牙齒、煙頭、口香糖、信封蓋和磁帶等）而設(shè)計，被廣泛采用[32-34]。該方法一次最大樣本量為50 mg 的骨粉或牙粉，經(jīng)PrepFilerTMBTA 法醫(yī)DNA 提取試劑盒裂解，1.0 mol/L 二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）和蛋白酶K 混合混勻，在56 ℃孵育2 h 后，即可進入磁珠結(jié)合、洗滌、洗脫步驟。該方法相較傳統(tǒng)的脫鈣提取法，大大減少了孵育時間，并且在大樣本量提取需求時結(jié)合工作站，可以實現(xiàn)自動化提取，如利用PrepFilerTMBTA 法醫(yī)DNA 提取試劑盒和AutoMate ExpressTM系統(tǒng)[35-36]，可在3 h 內(nèi)完成骨骼DNA提取。

2.2 DNA 修復

隨著大規(guī)模平行測序（massively parallel sequencing，MPS）技術(shù)檢測低水平變異頻率的閾值降低，死后50 年以上的陳舊骸骨DNA 被證明存在干擾后續(xù)遺傳標記檢測及其結(jié)果解釋的損傷[37-38]。考古學中，骸骨DNA 常見胞嘧啶脫氨損傷，即C→T、G→A改變。有研究[39]證明，這類DNA 損傷中的尿嘧啶可以被尿嘧啶-N-糖基化酶（uracilN-glycosylase，UNG）有效去除。NEBNext 甲醛固定和石蠟包埋組織DNA 修復試劑盒不僅可以切除脫氨氮胞嘧啶殘基，還可以修復雙鏈DNA（double-stranded DNA，ds-DNA）以保留用于PCR 的長片段。未經(jīng)處理的線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）PCR 擴增子序列中檢見高達850 個因胞嘧啶脫氨導致的C→T、G→A改變，而經(jīng)該試劑盒修復的DNA 結(jié)果中此類變異降低為10 個[37]。PreCRTM修復混合液可以修復氧化性損傷DNA 和紫外線照射性損傷DNA，表現(xiàn)為修復后DNA 的STR 檢測信號增加。但是在陳舊骸骨DNA 上絕大多數(shù)基因座檢測信號卻減少了，表明骸骨樣本可能包含多種類型損傷，而PreCRTM酶只適用于雙鏈構(gòu)象DNA[40-41]。綜上，損傷DNA 修復既可以產(chǎn)生更好的檢測結(jié)果以幫助結(jié)果解釋，還可以節(jié)省樣本和反復實驗的消耗成本，可以在實踐中考慮使用。

綜上所述，陳舊骸骨DNA 提取關(guān)鍵在于降低污染和最大程度回收DNA。當樣本條件差時，取0.5～1 g骨粉單次提取可以減少樣本暴露和轉(zhuǎn)移，采用完全脫鈣處理能夠盡可能釋放殘余DNA，最后可經(jīng)過柱提法或磁珠法純化回收。當樣本數(shù)量眾多且保存條件尚可時，可以采用PrepFilerTMBTA 法醫(yī)DNA 提取試劑盒，骨粉投入量小（25 mg），且結(jié)合磁珠法能夠?qū)崿F(xiàn)批量自動化提取，效率高。此外，DNA 修復處理能夠在一定程度上提高某類損傷DNA 的鑒定結(jié)果質(zhì)量，建議用于陳舊骨骼DNA 個體識別鑒定。

3 目標片段分析方法

陳舊骸骨檢材的個體識別鑒定策略包括片段分析和序列分析。片段分析即特定遺傳標記檢測，如STR、miniSTR、SNP 等；序列分析指測序獲得樣本部分或全部序列信息，如Sanger 測序mtDNA 高變區(qū)序列。由于陳舊骸骨內(nèi)源性DNA 數(shù)量有限且常伴隨DNA 降解和損傷，為獲取足夠可信的DNA 分型數(shù)據(jù)需要在檢測前進行目標DNA 片段富集。常用的DNA片段富集方法為多重PCR 技術(shù)和雜交捕獲技術(shù)，不同的富集技術(shù)需要結(jié)合特定的檢測方法。本部分重點介紹以下幾種富集技術(shù)與檢測方法的組合及應用。

3.1 多重PCR-毛細管電泳

多重PCR 技術(shù)可以同時擴增成百上千條特定序列，高效利用有限的DNA，同時兼容多種遺傳標記，如STR、miniSTR、SNP 等，適用于高度降解DNA。目前，基于毛細管檢測平臺的商品化STR 身份鑒定系統(tǒng)在陳舊骸骨DNA 鑒定案例中仍為首選。早期案例中通常聯(lián)合多種STR 遺傳標記以增加檢出的基因座，如2015 年，10 例二戰(zhàn)期間位于波斯尼亞和黑塞哥維那的遺骸樣本經(jīng)15 個常染色體STR 和23 個Y-STR 分型，其中9 例獲得有價值的常染色體STR 圖譜，成功用于死后70 年的受害者身份鑒定，親屬匹配率達60%[42]。另1 例報道[34]中，335 名意大利人在二戰(zhàn)期間于羅馬附近被德國納粹屠殺，法醫(yī)專家小組經(jīng)過多種STR 基因座分型，確認了其中323 名受害者（成功率為96.42%）。1990—2018 年，AFDIL 對2 177 份骸骨和1 656 顆牙齒進行了分析鑒定以尋找戰(zhàn)爭中失蹤的美軍人員，主要依靠聯(lián)合應用多重擴增常染色體STR、Y-STR、miniSTR、mtDNA 等遺傳標記[5]。2021 年，鑒定人員采用21 個常染色體STR 和23 個Y-STR 分型，完成了2 例土埋40 余年股骨的親權(quán)鑒定分析[43]。

2021 年以來，多項陳舊骸骨鑒定研究[7,20,44]采用美國Thermo Fisher Scientific 公司推出的六色熒光標記試劑盒GlobalFilerTMPCR 擴增試劑盒[45]，其包含所有DNA 聯(lián)合索引系統(tǒng)（combined DNA index system，CODIS）基因座、歐洲常用STR 和10 個miniSTR，不僅具有全球DNA 數(shù)據(jù)庫兼容性，還專門針對降解DNA、痕量DNA 和低水平DNA 樣本。因此，GlobalFilerTMPCR 擴增試劑盒作為單個STR 鑒定系統(tǒng)，因涵蓋多種STR 基因座且便捷省時成為熱門選擇。此外，ZUPANI? PAJNI? 等[44]嘗試用高通量測序技術(shù)檢測GlobalFilerTMPCR 擴增試劑盒中的基因座序列，不僅提高了單獨應用毛細管電泳分型無法獲得的圖譜比例，還發(fā)現(xiàn)了多個序列雜合性等位基因。值得注意的是，陳舊的骨骼和牙齒檢材通常攜帶環(huán)境微生物，從而產(chǎn)生微生物來源偽峰，這類偽峰在骨骼和牙齒的STR 圖譜中并不罕見[46]，因此，正確認識此類現(xiàn)象并且準確解釋STR 圖譜非常重要。

3.2 mtDNA 擴增-Sanger 測 序

mtDNA 拷貝數(shù)目多、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、高突變區(qū)變異頻率高，是檢測微量、高度降解骸骨和牙齒樣本的常用遺傳標記。mtDNA 具有母系遺傳特點，常與STR、SNP 遺傳標記聯(lián)合使用，起到排除或不排除母系關(guān)系的作用。鑒定應用中，通常擴增和測序mtDNA 的高變區(qū)（hypervariable region，HV）Ⅰ、HVⅡ 2個片段便可以得到理想效果，如斯洛文尼亞的萬人坑中，88例受害者殘骸中的HVⅠ和HVⅡ檢出率分別達到95%和98%，這些殘骸距身份鑒定已間隔65 年（1945—2010 年）[47]。俄國沙皇遺骨鑒定案例中，骸骨在死后73 年被發(fā)現(xiàn)，英國法庭科學服務部通過比對每具骸骨的mtDNA 控制區(qū)740 bp 序列和俄皇后母系直系后裔曾外甥的mtDNA 序列，確證了骸骨的皇族成員身份[48]。mtDNA檢測靈敏度極高，實驗過程中建立完整的防污染系統(tǒng)規(guī)范十分重要，如實驗區(qū)域的絕對清潔，實驗前后充足的消毒滅菌處理，實驗人員完備的防護措施，實驗各個階段添加陽性和陰性對照品，PCR 前后分區(qū)域進行操作以及DNA 質(zhì)量控制數(shù)據(jù)庫等。

3.3 下一代測序

3.3.1 STR 和SNP

高通量測序技術(shù)又稱下一代測序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）能夠同時檢測STR 基因座的長度多態(tài)性和序列多態(tài)性，可兼容STR、SNP 多種遺傳標記，同時測序多個樣本，使得鑒定效率得到很大的提高。目前，美國Verogen 公司推出的ForenSeqTMDNA Signature Prep 試劑盒在高通量鑒定應用中占主導地位[49]，最多可檢測230 個基因座，涵蓋27 個常染色體STR、24 個Y-STR、7 個X-STR、94 個個體識別SNP、22 個表型SNP 和56 個生物祖先SNP，其中絕大多數(shù)基因座產(chǎn)物長度小于200 bp，非常適合陳舊骸骨和牙齒高度降解樣本的鑒定。ZHANG 等[50]通過模擬痕量和降解樣本實驗得出，F(xiàn)orenSeqTMDNA Signature Prep 試劑盒在DNA 模板為50 pg 或樣本高度降解[降解系數(shù)（degradation index，DI）為72.28]時，可以檢出大于80%的等位基因。SHARMA 等[51]使用一系列降解DNA 樣本和24 個種類為骨骼、血卡和牙齒的模擬案件樣本測試ForenSeqTMDNA Signature Prep 試劑盒。兩組連續(xù)降解的DNA 樣本結(jié)果顯示，當DI>4 時，STR 開始丟失。丟失的位點主要是具有長擴增子以及低讀數(shù)（覆蓋率）的基因座，如PentaE、DXS8378和rs1736442。然而，嚴重降解的DNA（DI 為44）仍能獲得18 個CODIS 基因座（占比90%）。作者模擬的多種類型案件樣本與上述降解DNA 樣本結(jié)果相符[51]。研究[51]表 明，F(xiàn)orenSeqTMDNA Signature Prep 試劑盒可以成功用于降解DNA 樣品。同年，在南非開普敦海岸發(fā)現(xiàn)的腐爛的人類下肢和手鑒定案例中，采用ForenSeqTMDNA Signature Prep 試劑盒高通量測序，確認了2 份檢材來自同一個體，協(xié)助遺體的識別和認親。該案例是全球首次采用高通量測序方法從海洋分解的軟組織裂解物中獲得完整DNA 的報道[52]。

3.3.2 mtDNA 全序列

基于高通量測序平臺，美國Thermo Fisher Scientific 公司的精準身份識別mtDNA 全基因組試劑盒[53]包含162 對多重擴增引物，以平鋪方法覆蓋整個線粒體基因組。這些引物對平分于2 個離心管，擴增子平均長度為163 bp，起始DNA 低至2 pg，專門針對高度受損、降解的牙齒和骨骼樣本。該線粒體基因組高通量測序試劑盒已經(jīng)被驗證效果良好[54-55]。

3.3.3 雜交捕獲

自2010 年以來，雜交捕獲在法醫(yī)學領(lǐng)域獲得了關(guān)注。雜交捕獲的主要優(yōu)勢是適用于降解DNA，沒有PCR 引物對數(shù)限制及可能的錯配和污染[56]。雜交捕獲通常是在提取的DNA 模板進行基因組庫制備后引入的，以便富集mtDNA 或核基因組內(nèi)的目的片段，應用MPS 生成DNA 序列[56]。在陳舊、降解的骨骼樣本中，內(nèi)源性人類DNA的比例可能非常低，而雜交捕獲技術(shù)能成功應用于含有少于1%內(nèi)源性DNA、平均長度僅為70 bp 的古人類DNA 鑒定中[57]。在法醫(yī)學研究中，雜交捕獲方案首先被應用于陳舊樣本的mtDNA序列鑒定[58-59]。例如，TEMPLETON 等[60]應 用DNA 探針捕獲技術(shù)檢測7 例二戰(zhàn)期間（約70 年）和考古樣本（約2 500 年）中的骸骨樣本，經(jīng)2 輪雜交捕獲得到了近100%的線粒體基因組覆蓋率，成功在5 例樣本中獲得線粒體基因組圖譜。BOSE等[61]提出了最早用于法醫(yī)學樣本檢測的SNP捕獲體系之一，該體系含451個遺傳標記，即375 個SNP 和36 個微單倍型，其在模擬降解樣本上表現(xiàn)良好，相比于PCR 富集，SNP 回收率有所提高。對于片段長度≤75 bp 的樣本，該體系使用0.5 ng DNA 可以分析98%以上的SNP，回收片段小至25 bp，非常適用于高度降解的DNA 檢測[61]。GORDEN 等[62]構(gòu)建了25 000 個和95 000 個SNP 捕獲體系，用于14 例死后75 年骸骨樣本共計21 對親緣關(guān)系鑒定，分別成功鑒定出16 和17 個成對的親緣關(guān)系，包括親子、全同胞、祖孫、叔侄、祖侄關(guān)系等。雜交捕獲對于STR 富集具有可嘗試性[63]，但效果不佳。值得注意的是，目前雜交捕獲技術(shù)靈敏度欠佳，成本高，使用者工作強度大。

3.4 基因芯片

基因芯片可以同時檢測多個樣本的多個遺傳標記，具有快速檢測的特點，在高通量測序早期階段應用較多。2014 年，針對濟州特別自治道大規(guī)模陳舊骸骨（1948 年遇難者）鑒定需求，韓國法醫(yī)學專家開發(fā)了一個基于美國Affymetrix 公司重測序陣列平臺的169 個個體識別SNP 檢測芯片，測試結(jié)果顯示，該芯片中120 多個SNP 能夠在低至約10 pg 的DNA 樣本和人工降解樣本中獲得分型[64]。濟州特別自治道402具骸骨的鑒定過程中，該芯片作為SNP 分型的補充工具，在74 具可得STR 圖譜的基礎(chǔ)上增加檢出了51 具骸骨的分型，為STR 數(shù)據(jù)不足的樣本增加了遺傳信息[65]。

綜上所述，多重PCR-CE 技術(shù)及結(jié)果解釋規(guī)范、成熟，產(chǎn)品豐富，效果穩(wěn)定，在全球法醫(yī)實驗室普遍適用，且數(shù)據(jù)量積累龐大，便于開展陳舊骸骨DNA 個體識別及比對工作，因此，當前及短期內(nèi)陳舊骸骨的DNA 鑒定仍將以多重PCR-CE 技術(shù)為首選。為了從微量的陳舊骸骨DNA 中解析更多個體的遺傳信息，基于高通量測序技術(shù)的研發(fā)正在快速發(fā)展并逐漸成為取代CE 技術(shù)的強有力手段。此外，高通量測序技術(shù)低成本化發(fā)展且可以融合更多創(chuàng)新技術(shù)，越來越多新技術(shù)的引入也將促進高通量測序在陳舊檢材鑒定中的作用。測序前片段富集方面，多重PCR 雖然存在引物對容量和平衡的問題，但從技術(shù)便捷性和成熟性方面考慮，仍然具有壓倒性優(yōu)勢，而雜交捕獲技術(shù)則需要進一步優(yōu)化過程，降低成本。

4 展 望

近5 年，隨著高通量測序技術(shù)逐漸低成本化以及多學科間交叉融合研究和發(fā)展，陳舊骸骨DNA 檢測技術(shù)不斷被探索和完善，可檢測的骨骼類型豐富，DNA 回收量和回收率提高，靶向型高通量測序體系快速發(fā)展。綜合相關(guān)研究和案例，在陳舊骨骼鑒定中，選取長骨樣本成功率高，DNA 提取時確保完全鈣化并減少液體轉(zhuǎn)移步驟，有利于DNA 回收。目的片段富集以多重擴增技術(shù)為主，結(jié)合高通量測序平臺，是目前實現(xiàn)陳舊骨骼高效檢驗的最優(yōu)組合。值得思考的是，骸骨的保存狀態(tài)對DNA 檢驗起到?jīng)Q定性作用。骸骨被發(fā)掘前的保存環(huán)境十分復雜，如溫度、濕度、酸堿度、深度、微生物集群等，這些外界環(huán)境因素對骸骨DNA 的影響和關(guān)聯(lián)性有待進一步研究。此外，目前骨骼DNA 采樣部位通常是根據(jù)鑒定人員經(jīng)驗來決定，有時會對保存較差的骸骨樣本造成較大甚至不可逆的破壞性。如果能夠加入影像學手段，如CT[66]和X 射線以幫助判斷骨骼或牙齒狀態(tài)，有針對性地選用適量體積，可以在解決骸骨DNA 鑒定的同時對骸骨進行最大程度的保護。此外，陳舊骸骨的DNA 分析中，如何把握分型結(jié)果的準確性十分重要。如上文所描述，陳舊骸骨DNA 分型圖譜可能存在微生物引入的偽峰，當DNA 高度降解且為痕量，測序會出現(xiàn)次要等位基因未達閾值的假陰性現(xiàn)象等。本文綜述了當前骨骼和牙齒DNA 檢測的主要技術(shù)，特別針對陳舊降解骸骨，為相關(guān)人員的應用和研究提供參考。