直腸癌組織中ADAM12、A2aR表達(dá)水平與神經(jīng)脈管侵犯及5-FU化療敏感性的關(guān)系

張琦玥 李義芬 王鳳西

直腸癌(carcinoma of the rectum)屬于大腸癌的一種,癌癥病變處為直腸與乙狀結(jié)腸的交接處至齒狀線[1-3],即起源于直腸和肛管的癌癥統(tǒng)稱為直腸癌,是消化道中常見的惡性腫瘤[4]。早期直腸癌的預(yù)后比較好,如果通過根治性手術(shù)切除,患者可以長(zhǎng)期存活[5-6]。晚期直腸癌的預(yù)后比較差,可危及患者生命。在我國(guó)直腸癌的發(fā)生率較結(jié)腸癌高60%,且隨著我國(guó)人口老齡化,結(jié)直腸癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[7-8]。去整合素金屬蛋白酶12(ADAM12)在腫瘤病變中異常高表達(dá)。A2a 型腺苷受體(adenosine 2a receptor,A2aR)能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞干性提高,激活腫瘤通路,促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于ADAM12、A2aR與直腸癌關(guān)系的研究較少。因此,本實(shí)驗(yàn)就直腸癌組織中ADAM12、A2aR表達(dá)水平與神經(jīng)脈管侵犯及5-FU化療敏感性的關(guān)系展開以下研究。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取我院2019年6月到2021年6月收集的62例新型輔助放化療治療前活檢石蠟標(biāo)本及術(shù)后腫瘤組織標(biāo)本。男性33例,女性29例,年齡30～85歲,平均(54.63±2.45)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):①術(shù)前患者均采用腸鏡活檢病理,影像學(xué)檢查。②所有標(biāo)本均在術(shù)中取出時(shí)使用10%的福爾馬林液體進(jìn)行保存,直至石蠟包埋。③所有患者癌組織均取自癌腫瘤全層并且剔除壞死組織。④符合《實(shí)用結(jié)直腸癌外科學(xué)》[9]中關(guān)于直腸癌的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn):①患者在診斷治療前未接受相關(guān)治療。②對(duì)藥物過敏患者。③合并有心肝腎等臟器腫瘤性病變。④不能完成實(shí)驗(yàn)全過程者。

1.2 試劑

采用上海雅吉生物科技有限公司提供的兔多克隆抗體anti-A2aR(貨號(hào)ab5236),羊抗人ADAM12多克隆抗體、通用型二抗試劑盒、山羊二抗試劑盒來自艾博抗上海貿(mào)易有限公司(貨號(hào)ab4215),DAB顯色試劑盒、蘇木精染液、中性樹膠來自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 治療方法 術(shù)后第10天,經(jīng)鎖骨下穿刺或切開頭靜脈,將化療泵導(dǎo)管置入上腔靜脈,經(jīng)X線證實(shí)導(dǎo)管位置后,固定導(dǎo)管,注藥泵埋于胸大肌上緣皮下,切口以可吸收線縫合。以無損傷針刺入注藥泵并用不粘帖固定,推注肝素鹽水回抽證實(shí)導(dǎo)管通暢,靜脈點(diǎn)滴艾恒200 mg,2小時(shí)以上;然后接三通管,用化療泵球囊(200 ml)持續(xù)靜脈點(diǎn)滴5-FU 3000～3500 mg,96 h,同時(shí)每天輸注CF 200 mg,21天為1個(gè)周期。為保證治療順利完成,預(yù)防消化道反應(yīng),采用格拉司瓊、維生素B等藥物靜脈點(diǎn)滴,口服升白細(xì)胞藥物及保肝藥物等。均行4個(gè)以上治療周期。

1.3.2 ADAM12、A2aR的檢測(cè)方法 實(shí)驗(yàn)前取兩塊石蠟切片,分別用來檢測(cè)ADAM12與A2aR。通過使用二甲苯Ⅰ、Ⅱ?qū)κ炃衅M(jìn)行脫蠟25 min,采用四川科倫藥業(yè)有限公司提供的梯度酒精100%、95%、75%、50%逐級(jí)水化5 min,各5 min。使用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)沖洗10 min,共2次。沖洗完后加入ADAM12一抗(1∶200),在36.5 ℃溫度下孕育1 h后再次進(jìn)行PBS沖洗,加入DAB顯色劑,后進(jìn)行常規(guī)的沖洗、脫水封片,制成AMAM12標(biāo)本。A2aR則在PBS沖洗后加入一抗A2aR、CD133。在36.5 ℃下持續(xù)孕育孵化1 h,PBS沖洗3次,甩干后用辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液滴在組織上,繼續(xù)在36.5 ℃下孕育30 min,再用PBS沖洗3次。加入DAB顯色劑待完成后用PBS沖洗,完成顯色后,用蘇木精反藍(lán),用梯度酒精脫水,二甲苯封片。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1 5-FU化療敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn) 采用直腸癌消退分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(rectal cancer regression grade,RCRG)進(jìn)行分級(jí),Ⅰ級(jí)腫瘤放療反應(yīng)好,肉眼可看病灶減小或不見,鏡下癌細(xì)胞不可見或僅剩下少量的癌灶;Ⅱ級(jí)鏡下有明顯的纖維化,肉眼可見的腫瘤存在;Ⅲ級(jí)腫瘤反應(yīng)較差,肉眼可見沒有變化,鏡下極少纖維化或無纖維化。

1.4.2 ADAM12結(jié)果判定 在直腸癌中染色觀察為棕褐色、棕黃色,染色位置位于胞質(zhì)和胞膜,細(xì)胞核不染色。染色標(biāo)準(zhǔn)判定:0分為無色、1分為淡黃色、2分為棕黃色、3分為棕褐色。細(xì)胞著色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):1分為0～25%,2分為25%～50%,3分為50%～75%,4分為75%～100%。評(píng)判結(jié)果由著色細(xì)胞數(shù)與染色強(qiáng)度乘積為判定標(biāo)準(zhǔn):陰性<4分,≥4分為陽性。

1.4.3 A2aR判定結(jié)果 陽性為細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃染顆粒。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):0分為不著色,1分為黃色,2分為棕黃色,3分為黃褐色。陽性細(xì)胞比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):1分為≤25%,>25%～50%為2分,>50%～75%為3分,>75%為4分。陽性判定標(biāo)準(zhǔn):分值為上兩項(xiàng)判斷標(biāo)準(zhǔn)乘積,總分為12分。陰性(-)(+/-),陽性(+)(++)。0～4分為陰性,5～12為陽性。以上2組判定結(jié)果均有兩名病理科主治醫(yī)師綜合判定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以百分率表示,采用χ2檢驗(yàn)。使用Spearman分類變量分析A2aR與ADAM12的表達(dá)強(qiáng)度和化療敏感性相關(guān)性。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A2aR、ADAM12在直腸癌組織中的表達(dá)

A2aR胞膜胞質(zhì)呈現(xiàn)黃色顆粒狀,陰性者21例,陽性者41例。ADAM12胞漿胞質(zhì)呈現(xiàn)棕褐色或棕黃色,陰性為23例,陽性為39例。

2.2 新型5-FU化療效果

所有患者中對(duì)新型5-FU化療敏感者(RCRG Ⅰ～Ⅱ級(jí))為30(48.38%)例,不敏感者32(51.62%)例。2.3 直腸癌中A2aR、ADAM12蛋白表達(dá)與化療敏感性和臨床病理學(xué)特征關(guān)系

A2aR蛋白的表達(dá)與腫瘤大小、患者性別、年齡大小、神經(jīng)脈管侵犯程度無關(guān)(P>0.05),與TNM分期、浸潤(rùn)程度有關(guān)(P<0.05)。ADAM12蛋白的表達(dá)與腫瘤大小、患者性別、年齡大小、神經(jīng)脈管侵犯程度無關(guān)(P>0.05),與浸潤(rùn)程度、TNM分期有關(guān)(P<0.05)。直腸癌化療敏感性與浸潤(rùn)程度、TNM分期、A2aR和ADAM12表達(dá)強(qiáng)度有關(guān)(P<0.05)。見表1。

表1 直腸癌中A2aR、ADAM12蛋白表達(dá)及化療敏感性與臨床病理學(xué)特征關(guān)系/例

2.4 直腸癌組織中A2aR、ADAM12與5-FU化療敏感性的相關(guān)性

直腸癌組織中A2aR表達(dá)與5-FU化療敏感性呈正相關(guān)(γ=0.352,P<0.001)。直腸癌組織中ADAM12表達(dá)與5-FU化療敏感性呈正相關(guān)(γ=0.276,P<0.030)。見表2。

表2 直腸癌組織中A2aR、ADAM12與5-FU化療敏感性的相關(guān)性/例

3 討論

化療是直腸癌患者最為重要的治療環(huán)節(jié),選擇何種的化療方式能有效決定患者病情的走向。化療藥物作用的形式均是殺死直腸癌細(xì)胞的表達(dá)因子,本研究中ADAM12、A2aR均是直腸癌細(xì)胞的重要表達(dá)因子。

A2aR是與腺苷結(jié)合共同抑制免疫細(xì)胞CD8+T,以此達(dá)到腫瘤免疫逃逸。SHI等[10]研究發(fā)現(xiàn)A2aR通過CD8+T時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)使其凋零,進(jìn)行免疫逃逸。腺苷與A2aR結(jié)合能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞干性提高,激活腫瘤通道促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[11-12]。干性的腫瘤細(xì)胞能通過細(xì)胞周期阻滯,抑制凋零,降低DNA損傷的修復(fù),因此對(duì)抗腫瘤免疫的恢復(fù)與阻斷A2aR能有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果顯示A2aR表達(dá)與5-FU化療敏感性呈正相關(guān),在直腸癌治療中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài),A2aR能成為治療直腸癌的新靶點(diǎn)。

ADAM12為ADAM重要成員之一。據(jù)有關(guān)研究顯示,正常情況下ADAM12在人足月胎盤中表達(dá)豐富[13]。目前研究顯示,多種腫瘤性病變均與ADAM12異常表達(dá)有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)[14],在胃癌組織中ADAM12呈現(xiàn)出高表達(dá),通過與粘附因子相互作用以及受體反式激活引起。本實(shí)驗(yàn)為了探究ADAM12在直腸癌中的表達(dá),對(duì)ADAM12進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)在直腸癌中呈現(xiàn)陽性表達(dá)。腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移是患者死亡的重要原因,ADAM12異常表達(dá)會(huì)引起結(jié)直腸癌腫瘤組織增殖與轉(zhuǎn)移。Wang、Dekky等[15-16]學(xué)者研究顯示ADAM12能增強(qiáng)腫瘤的侵襲。實(shí)驗(yàn)顯示ADAM12與TNM分期相關(guān)聯(lián)。在子宮癌患者中ADAM12呈現(xiàn)出高表達(dá),且TNM與ADAM12的表達(dá)水平呈現(xiàn)正相關(guān)性,增強(qiáng)了腫瘤的轉(zhuǎn)移與侵襲。實(shí)驗(yàn)中A2aR、ADAM12對(duì)神經(jīng)脈管具有侵犯,但不具有意義。

綜上所述,直腸癌患者中ADAM12、A2aR陽性表達(dá)率較高,對(duì)神經(jīng)脈管侵犯度不高,與5-FU化療敏感性呈現(xiàn)正相關(guān)。ADAM12、A2aR可作為直腸癌的靶點(diǎn)進(jìn)行針對(duì)治療,進(jìn)一步抑制結(jié)直腸癌的增殖與轉(zhuǎn)移。