miR-27a,miR-138-5p對食管癌的早期診斷價值及與其病理分化程度的關系研究

趙蓓蓓 吳 帥

食管癌是消化道常見惡性腫瘤,發病率和死亡率均較高,早期癥狀不明顯,診斷困難,70%～80%患者確診時已為中晚期,臨床主要通過手術、放療和化療等方式進行治療,但治療效果不甚滿意,5年生存率仍較低。因此,進行癌前病變及早期病變篩查具有重要意義,尋找有效的生物標志物,對于早期篩查及診斷至關重要。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類非編碼小分子RNA,可通過調控靶基因,參與體內信號傳導通路。miRNA與癌基因或抑癌基因關系密切,可作為腫瘤早期診斷的基礎,多種miRNA已被證實可作為乳腺癌、肝癌等惡性腫瘤早期診斷標志物及靶向治療靶點[1-2]。miR-27a與多種腫瘤發生發展過程密切相關,已有研究顯示其在食管鱗狀癌細胞增殖和遷移過程中發揮調控作用[3]。miR-138-5p在多種腫瘤中表達異常,與非小細胞肺癌腫瘤直徑、淋巴結轉移等病理特征有關,但其在食管癌中的作用報道尚少[4]。本研究通過實時熒光定量PCR技術檢測食管癌患者及正常人血清miR-27a、miR-138-5p表達水平,探討其對食管癌早期診斷價值及與病理特征的關系,旨在為臨床食管癌早期診斷提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2019年8月至2020年8月本院收治的食管癌患者73例,設為研究組。其中男性41例,女性32例,年齡38～76歲,平均年齡(65.23±5.26)歲;食管癌分段標準[5]:食管上段16例,中段32例,下段25例;TNM分期[6]:Ⅰ期19例,Ⅱ期32例,Ⅲ期13例,Ⅳ期9例。納入標準:①符合《食管癌診療規范》[7]診斷標準;②內鏡檢查及組織活檢確診為食管癌;③首次確診,未接受過手術、放化療及其他抗癌治療;④相關影像學及內徑資料,可進行腫瘤分期。排除標準:①年齡<18歲;②合并其他腫瘤;③合并嚴重慢性基礎性疾病或感染性疾病;④孕婦及哺乳期婦女。另選取同期本院體檢的健康人群59例,設為對照組,其中男性32例,女性27例,年齡35～78歲,平均年齡(66.21±5.89)歲,對照組人員體檢結果均正常,無既往腫瘤史。研究組與對照組年齡、性別構成比無顯著差異(P>0.05)。

本研究經醫院倫理委員會審批通過,所有參與者均對研究內容知情同意。

1.2 主要試劑和儀器

主要試劑:Trizol試劑(美國Invitrogen公司),SYBR Green qPCR Mix(德國merck公司),ThemoScript RT試劑盒(美國Invitrogen公司)。主要儀器:紫外分光光度計(德國Sartorius公司),PCR儀(美國Eppendorf公司)。

1.3 方法

1.3.1 標本采集與處理 分別采集兩組受試者清晨空腹肘靜脈血5 mL,抗凝管內靜置30 min,3500 r/min離心室溫15 min,取上清,-80 ℃保存。

1.3.2 血清總RNA提取 取保存血清樣本,解凍后加入Trizol試劑,充分混勻,12000 r/min離心5 min,加入氯仿室溫放置5 min,加入異丙醇室溫放置10 min,離心取上清,提取血清總RNA,采用紫外分光光度計測定260 nm和280 nm處吸光度(A)值,檢測RNA濃度和純度,A260nm/A280nm比值在1.8～2.1之間,表示提取的總RNA純度較高,可用于后續實驗。

1.3.3 逆轉錄反應 嚴格按照試劑盒說明書操作步驟,進行逆轉錄cDNA。逆轉錄反應體系:1 μL總RNA,1 μL dNTP Mixture,2 μL 5×RT Buffer,0.5 μL RNA酶抑制劑,1 μL 逆轉錄酶,加ddH2O至總體積20 μL。45 ℃反應30 min,85 ℃反應5 min。

1.3.4 實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR進行擴增。配制PCR擴增反應體系:SYBR Premix Ex Taq II 10 μL,上下游引物各0.5 μL,cDNA模板3 μL,加ddH2O至總體積20 μL。PCR反應條件:預變性95 ℃ 5 min,變性95 ℃ 10 s,退火60 ℃ 20 s,延伸72 ℃ 5 s,40個循環。以U6為內參,2-△△CT法對miR-27a,miR-138-5p進行相對定量,重復檢測3次,取平均值。實驗所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 2組血清miR-27a、miR-138-5p水平比較

研究組血清miR-27a表達水平高于對照組,miR-138-5p表達水平低于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 2組血清miR-27a、miR-138-5p水平比較

2.2 血清miR-27a、miR-138-5p表達與食管癌臨床病理特征的關系

血清miR-27a、miR-138-5p在不同年齡、性別、腫瘤位置及病理類型患者中表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。隨著病理分化程度升高,血清miR-27a表達水平降低、miR-138-5p表達水平升高(P<0.05);淋巴結發生轉移患者血清miR-27a高于未轉移患者、miR-138-5p表達水平低于未轉移患者(P<0.05);TNM分期IV期患者miR-27a表達水平最高、miR-138-5p表達水平最低,I-II期患者miR-27a表達水平最低、miR-138-5p表達水平最高,各期差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 miR-27a、miR-138-5p表達與患者臨床病理特征的關系

2.3 血清miR-27a,miR-138-5p單獨及聯合檢測對食管癌早期診斷價值

ROC結果顯示,血清miR-27a,miR-138-5p單獨診斷早期食管癌的最佳截斷點分別為7.32、2.51,單獨及聯合診斷的AUC分別為0.786、0.725、0.813,見表4,圖1。

表4 血清miR-27a,miR-138-5p單獨及聯合檢測對食管癌的早期診斷價值

圖1 miR-27a,miR-138-5p單獨及聯合檢測預測食管癌的ROC曲線

3 討論

食管癌早期診斷與治療是降低患者死亡率的關鍵,目前臨床食管癌診斷采用內鏡活檢,患者依從性差,且存在醫源性感染,外周血獲取簡單,創傷較小,患者容易接受,血清miRNAs在腫瘤早期篩查和診斷中具有廣泛應用前景[8]。miRNA在食管癌發生發展過程中發揮重要調控作用,通過靶向降解下游癌基因或抑癌基因,從上游抑制或促進腫瘤發生發展,部分miRNAs可作為腫瘤發生發展標志物,為腫瘤靶向治療提供潛在靶點[9]。鑒于此,本研究檢測食管癌患者與健康人群血清miR-27a、miR-138-5p表達水平,分析兩者對食管癌早期診斷的應用價值,結果顯示,食管癌患者血清miR-27a表達水平顯著高于正常人群,miR-138-5p表達水平顯著低于正常人群,與Maghsudlu等[10]報道的miR-27a在食管癌腫瘤組織中表達較高結果一致,Wang等[11]研究顯示,miR-138-5p在胃癌組織中表達下調,本研究在食管癌中也得到相似驗證,表明miR-27a、miR-138-5p與食管癌發生發展有關。

血清miRNA不易受外界環境影響,能夠長期保存,性質穩定,對于臨床動態觀察患者病情具有重要價值。血清miRNA與腫瘤生長有關,惡性腫瘤患者血清miRNA表達水平在根治性切除治療后,可逐漸升高/降低,miRNA表達水平可在一定程度預測腫瘤負荷[12]。腫瘤發展不同階段,miRNA譜系表達不同,可根據差異推測腫瘤惡性進展程度[13]。此外,血清miRNA還存在一定特異性,不同病理類型惡性病變,其miRNA表達譜系表達存在差異,有助于分析臨床中來源不明的低分化惡性病變[14]。miRNA異常表達與腫瘤發生發展密切相關,本研究分析血清miR-27a、miR-138-5p表達水平與患者臨床特征關系,結果顯示,病理分化程度越高,miR-27a表達水平降低、miR-138-5p表達水平升高;并且淋巴結發生轉移患者血清miR-27a高于未轉移患者、miR-138-5p表達水平低于未轉移患者;Ⅳ期患者miR-27a表達水平高于Ⅰ～Ⅱ期及Ⅲ期患者,而miR-138-5p表達水平較低,表明miR-27a、miR-138-5p表達在食管癌中具有較高敏感度,與食管癌惡性程度有關。

食管癌臨床特征發展不穩定,進展過程中有多個基因共同參與調控,目前臨床常用的血清腫瘤標志物鱗狀細胞癌抗原、C反應蛋白和細胞角蛋白19片段等,存在特異性不高、靈敏度差等問題,尤其對食管癌早期病變診斷價值不明顯。本研究進一步采用ROC曲線分析miR-27a、miR-138-5p在食管癌中的診斷價值,結果顯示,血清miR-27a、miR-138-5p單獨及聯合診斷早期食管癌的AUC分別為0.786、0.725、0.813,當臨界值取7.32時,miR-27a對食管癌診斷價值最大,靈敏度和特異度分別為80.82%、81.36%;當臨界值取2.51時,miR-138-5p對食管癌診斷的靈敏度和特異度分別為76.71%、77.97%,表明血清miR-27a、miR-138-5p是食管癌惡性程度增高的敏感指標,對食管癌具有一定診斷價值,兩者聯合檢測診斷價值更高。此外,miR-27a在大腸癌及卵巢癌患者中表達升高,診斷腫瘤敏感度較高,但特異性較低[15]。聯合miR-138-5p后,可提高診斷價值,有望成為診斷早期食管癌的分子標志物。

綜上所述,血清miR-27a在食管癌患者血清表達升高、miR-138-5p表達下降,與腫瘤病理分化程度、淋巴結轉移及TNM分期有關,兩者聯合檢測可為食管癌早期診斷提供依據。但本次研究樣本量較少,進一步可利用miR-27a、miR-138-5p在食管癌進展中表達失調,研究其可能作用機制及靶點,為臨床靶向治療食管癌提供潛在靶點。