褐藻素對Keap1/Nrf2/HO-1信號通路介導的前列腺癌DU145細胞氧化應激反應的影響

張俊強 萬久愷 姚浩宇 范 銳

前列腺癌是老年男性常見惡性腫瘤,死亡率僅次于肺癌,對男性人群健康造成嚴重影響。目前臨床可通過手術切除腫瘤,一定程度提高患者生存率,但存在復發風險,中晚期患者還可通過激素去勢治療,但多數患者易發生激素抵抗,導致病情惡化,嚴重影響患者生存質量[1-2]。因此,迫切需要尋找有效治療藥物以延緩病情進展,延長患者生存期。近年來,隨著對天然植物藥物的深入研究,多種中草藥及其提取物被發現具有明顯的抗腫瘤作用。褐藻素是從海帶科植物中提取的一種類胡蘿卜素成分,具有抗炎、抗病毒、抗氧化等藥理活性[3]。既往研究顯示,褐藻素可抑制宮頸癌細胞[4]、鼻咽癌細胞[5]增殖,具有明顯抗腫瘤作用。此外,褐藻素還被證實在非酒精性脂肪肝動物模型中具有抗氧化作用[6]。氧化應激與腫瘤進展關系密切,Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1(kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)/核因子E2相關因子2(nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2)/血紅素氧合酶-1(heme oxygenase 1,HO-1)信號通路是體內重要抗氧化應激通路,Keap1失活可引起Nrf2高表達,促進細胞增殖,誘發基因突變,在腫瘤進展中發揮重要作用[7]。鑒于此,本研究以前列腺癌DU145細胞為研究對象,分析褐藻素對癌細胞增殖凋亡的影響,并探討其作用機制,旨在為臨床開發相關藥物及治療前列腺癌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞系

人前列腺癌DU145細胞株,購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 主要試劑和儀器

褐藻素(98%)、2,7-二氯熒光黃乙酰乙酸(2',7'-dichlorodihydronuorescein diacetate,DCFH-DA)(美國sigma公司),含有Keap1 shRNA和陰性對照Keap1 shNC基因序列的pHBLV-U6-Scramble-ZsGreen-Puro質粒(蘇州吉瑪基因股份有限公司),丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒(南京建成生物工程研究所),兔抗人Keap1、Nrf2、HO-1、B細胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)一抗及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(英國Abcam公司),FITC-PI凋亡檢測試劑盒、流式細胞儀(美國BD公司),RT-PCR儀(美國Thermo Fisher Scientific公司),酶標儀、電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3 細胞培養

DU145細胞常規水浴復蘇后,置入培養箱中培養,培養環境為:含有10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養液,37 ℃、飽和濕度、5% CO2,每2～3 d換液1次,觀察細胞融至80%～90%時進行傳代。使用對數增殖期細胞。

1.4 MTT法檢測褐藻素對DU145細胞增殖的影響

取對數增殖期DU145細胞,棄去培養基,PBS漂洗3遍,胰酶消化、離心,重懸細胞密度為5×105個/mL,96孔板中每孔加入0.1 mL細胞懸液,置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h,之后加入不同濃度褐藻素(1、10、20、40、80 μmol/L),另設不加褐藻素的空白組,各設置5個復孔,培養48 h,每孔加入10 μL MTT溶液(5 g/L),繼續孵育4 h,棄上清,每孔加入150 μL二甲基亞砜,振蕩溶解結晶,使用酶標儀于490 nm處觀察各孔吸光(A)值,計算細胞增殖抑制率,細胞增殖抑制率=(1-各濃度褐藻素A值/空白組A值)×100%。

1.5 細胞轉染和分組

將對數增殖期DU145細胞,以5×105個/mL密度接種于6孔板,細胞融合至70%時,棄去原培養基,加入新鮮培養基,加入3×106U含有Keap1 shRNA和Keap1 shNC基因序列的pHBLV-U6-Scramble-ZsGreen-Puro慢病毒質粒,37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h,更換培養基,繼續培養48 h,加入嘌呤霉素篩選細胞,48 h后觀察細胞,未感染的空細胞死亡,而病毒感染細胞存活,表示轉染成功。將對數增殖期DU145細胞隨機分為對照組(常規培養)、Keap1 shRNA組(轉染Keap1 shRNA慢病毒質粒)、Keap1 shNC組(轉染Keap1 shNC慢病毒質粒)、褐藻素組(使用40 μmol/L褐藻素處理)和褐藻素+Keap1 shRNA組(穩定轉染Keap1 shRNA后,使用40 μmol/L褐藻素處理)。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

各組細胞以5×105個/mL密度接種于6孔板,37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h,棄去培養基,PBS漂洗,胰酶消化后,置于離心管中,1000 r/min,離心5 min,棄上清,使用PBS重懸細胞,1000 r/min離心5 min,棄上清后收集細胞,加入200 μL 1×Binding Buffer重懸細胞,加入5 μL Annexin-FITC結合懸浮細胞,室溫避光孵育10 min,之后加入10 μL PI染色液,4 ℃避光孵育10 min,1 h內使用流式細胞儀進行分析,檢測細胞凋亡率,重復3次,取平均值。細胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.7 流式細胞術檢測細胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平

各組細胞于6孔板中,37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h,胰酶消化,1000 r/min離心5 min,棄上清后收集細胞,PBS漂洗2遍,計數1×105個細胞,加入終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA染液,37 ℃孵育30 min,PBS漂洗,使用流式細胞儀檢測細胞熒光強度,以熒光強度反映細胞內ROS水平。

1.8 檢測細胞中SOD、GSG-Px活力和MDA含量

各組細胞于6孔板中,37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h,收集培養上清,1500 r/min離心2 min,按照試劑盒說明書操作步驟,逐步添加試劑,均勻混合,酶標儀測量A值,檢測細胞中SOD、GSG-Px活力和MDA含量。

1.9 RT-qPCR檢測細胞中mRNA表達

收集各組細胞,TRizol法提取總RNA,測定RNA濃度和純度。將RNA逆轉錄為cDNA,進行PCR反應。配制反應體系:10 μL SYBR Prmix Ex Taq,正向引物和反向引物各0.8 μL,2 μL cDNA模板,滅菌水補至總體積20 μL。將配制好的溶液置于PCR儀上進行反應,反應參數:95 ℃ 5 s,95 ℃ 30 s,60 ℃ 10 s,重復40個循環。以GDPAH為內參,采用2-△△CT法進行相對定量。實驗所用引物序列見表1。

表1 引物序列

1.10 Western blot法檢測細胞中蛋白表達

收集各組細胞,PBS漂洗,加入RIPA冰上裂解30 min,12000 r/min離心15 min,收集上清,BCA法測定蛋白濃度。每孔20 μg上樣,進行SDS-PAGE凝膠電泳(110 V,2 h)并轉膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,4 ℃孵育一抗(Keap1、Nrf2、Ho-1、Bcl-2、Bax,均1∶500稀釋)過夜,TBST洗膜,室溫孵育二抗(辣根過氧標記的IgG,1∶2000稀釋)2 h。ECL顯影、定影,使用ImageJ軟件掃描灰度并定量,以Keap1、Nrf2、Ho-1與內參照GAPDH灰度比值作為其相對表達量。

1.11 統計學分析

2 結果

2.1 不同濃度褐藻素對DU145細胞增殖的影響

空白組和1、10、20、40、80 μmol/L濃度褐藻素組細胞增殖抑制率分別為:0、(13.26±2.45)%、(21.33±2.79)%、(34.75±3.42)%、(49.53±3.41)%、(65.74±4.07)%。細胞增殖抑制率隨著褐藻素濃度增加而升高,呈濃度依賴性(P<0.05)。后續實驗選取增殖抑制率接近50%的褐藻素工作濃度,即40 μmol/L。

2.2 各組細胞凋亡率

與對照組和Keap1 shNC組比較,Keap1 shRNA組細胞凋亡率降低(P<0.05);褐藻素組細胞凋亡率升高(P<0.05)。褐藻素+Keap1 shRNA組細胞凋亡率高于Keap1 shRNA組,低于褐藻素組(P<0.05)。見表2,圖1。

表2 各組細胞凋亡率

2.3 各組細胞ROS水平

與對照組和Keap1 shNC組比較,Keap1 shRNA組細胞ROS水平升高(P<0.05);褐藻素組細胞ROS水平低于對照組(P<0.05);褐藻素+Keap1 shRNA組細胞ROS水平低于Keap1 shRNA組,高于褐藻素組(P<0.05)。見表3,圖2。

2.4 各組細胞SOD、GSH-Px活力和MDA含量

與對照組和Keap1 shNC組比較,Keap1 shRNA組SOD和GSH-Px活力降低,MDA含量升高(P<0.05);褐藻素組較對照組SOD和GSH-Px活力升高,MDA含量降低(P<0.05);褐藻素+Keap1 shRNA組SOD和GSH-Px活力高于Keap1 shRNA組而低于褐藻素組,MDA含量低于Keap1 shRNA組而高于褐藻素組(P<0.05)。見表4。

圖1 流式細胞術檢測細胞凋亡

2.5 各組細胞mRNA表達水平

與對照組和Keap1 shNC組比較,Keap1 shRNA組Keap1 mRNA表達降低,Nrf2和Ho-1 mRNA表達升高(P<0.05);褐藻素組Keap1 mRNA表達高于對照組,Nrf2和Ho-1 mRNA表達低于對照組(P<0.05);褐藻素+Keap1 shRNA組Keap1 mRNA表達高于Keap1 shRNA組低于褐藻素組,Nrf2和Ho-1 mRNA表達低于Keap1 shRNA組高于褐藻素組(P<0.05)。見表5。

表3 各組細胞ROS水平

圖2 流式細胞術檢測ROS水平

表4 各組SOD、GSH-Px活力和MDA含量

表5 各組細胞Keap1、Nrf2和Ho-1 mRNA表達水平

2.6 各組細胞蛋白表達水平

與對照組和Keap1 shNC組比較,Keap1 shRNA組Keap1、Bax蛋白表達降低,Nrf2、Ho-1和Bcl-2蛋白表達升高(P<0.05);褐藻素組Keap1、Bax蛋白表達高于對照組,Nrf2、Ho-1和Bcl-2蛋白表達低于對照組(P<0.05);褐藻素+Keap1 shRNA組Keap1、Bax蛋白表達高于Keap1 shRNA組低于褐藻素組,Nrf2、Ho-1和Bcl-2蛋白表達低于Keap1 shRNA組高于褐藻素組(P<0.05)。見表6,圖3。

3 討論

氧化還原反應在機體內普遍存在,氧化還原態的失衡與細胞增殖、分化、凋亡及基因轉錄、細胞信號轉導等生物學過程密切相關。乏氧環境、炎性因子等外界環境可導致細胞氧化還原失衡,使細胞發生惡性轉化,引起腫瘤;同時腫瘤細胞發生氧化應激,產生大量ROS,促進腫瘤細胞突變和分裂,進一步誘導腫瘤進展[8-9]。氧化應激與前列腺癌發生發展過程關系密切,參與腫瘤細胞上皮間質轉化、耐藥性和凋亡等過程,并可增強雄激素信號傳導,促進去勢抵抗性前列腺癌進展,給臨床治療前列腺癌帶來極大挑戰[10]。

表6 各組細胞蛋白表達水平

圖3 各組細胞蛋白表達電泳圖

褐藻素是一種海洋類胡蘿卜素,可通過多種途徑對不同類型腫瘤發揮抗腫瘤作用。Wang等[11]研究顯示,褐藻素可降低乳腺癌細胞和乳腺癌裸鼠模型中微淋巴管密度,體內外均發揮淋巴管抑制作用,可作為乳腺癌患者抗腫瘤轉移的潛在途徑。Mei等[12]報道,褐藻素在非小細胞肺癌細胞中的抗增殖具有劑量和時間依賴性,可通過阻滯細胞周期誘導細胞凋亡。本研究使用不同濃度褐藻素處理前列腺癌DU145細胞,結果顯示細胞增殖活力明顯降低,提示褐藻素對DU145細胞增殖的抑制作用,此外,褐藻素處理的細胞凋亡率較對照組明顯升高,提示褐藻素對DU145細胞凋亡的促進作用,證實褐藻素可抑制DU145細胞增殖并誘導細胞凋亡,具有潛在抗前列腺癌作用。

ROS在細胞增殖、分化和凋亡過程廣泛存在,高濃度ROS可導致氧化還原系統失衡,引起細胞損傷,ROS攻擊生物膜中不飽和脂肪酸,形成MDA等脂質過氧化物,MDA水平可反映氧化應激損傷程度。機體內SDO、GSH-Px等抗氧化酶可形成內源性防御機制,使機體免受ROS引起的氧化應激,SOD能夠催化超氧自由基,清除ROS,當SOD活性下降時,細胞易受ROS攻擊引起損傷;GSH-Px可催化過氧化氫,減少脂質過氧化,保護細胞免受氧化損傷。為進一步研究褐藻素對前列腺癌DU145細胞誘導凋亡的作用機制,本研究對細胞中的ROS水平、SOD和GSH-Px活性及MDA含量進行了檢測,結果顯示,褐藻素組細胞中SOD和GSH-Px活性較對照組明顯升高,ROS水平和MDA含量明顯下降,表明褐藻素可平衡細胞氧化還原失衡狀態,減少氧化應激對腫瘤細胞的促進作用。有研究顯示,褐藻素可通過調控相關信號通路,減輕氧化應激,改善腎纖維化[13]。Zhang等[14]研究顯示,褐藻素可通過誘導Sirt1,減輕蛛網膜下腔出血中的氧化損傷,發揮神經保護作用。以上研究均提示褐藻素的抗氧化作用,本研究結果也證實褐藻素在前列腺癌DU145細胞中可通過抗氧化作用,促進細胞凋亡,可能與其類胡蘿卜素獨特的丙二烯鍵等結構能清除ROS有關,促進細胞內氧化還原系統維持在相對平衡狀態,進而減少DU145細胞過度增殖,并促進細胞凋亡。

Keap1/Nrf2/HO-1在維持機體氧化還原平衡中發揮關鍵作用,Nrf2對氧化應激高度敏感,主要受其胞質接頭蛋白Keap1調控,Keap1可促進Nrf2的泛素化降解過程[15]。正常情況下,Keap1和Nrf2以二聚體形式存在,氧化應激條件下,Keap1與Nrf2解離,導致Keap1-Nrf2通路失活,Nrf2轉移入核,與抗氧化反應元件結合,啟動下游編碼抗氧化蛋白類HO-1等表達,HO-1可保護腫瘤細胞免受損傷,促進細胞增殖,減少凋亡,并可增加腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性[16-17]。本研究敲降Keap1表達后,相較于對照組,Keap1 shRNA組細胞Keap1 mRNA和蛋白表達降低,Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白表達升高,發生明顯氧化應激反應,且抑制凋亡蛋白Bcl-2表達升高,促進凋亡蛋白Bax表達降低,細胞凋亡減少,而使用褐藻素處理的細胞Keap1 mRNA和蛋白表達升高,Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白表達降低,同時Bcl-2蛋白表達降低,Bax蛋白表達升高,提示褐藻素可能對Keap1/Nrf2/HO-1通路存在調控作用,進而誘導細胞發生凋亡。為闡明褐藻素對DU145細胞的作用機制,本研究在敲降Keap1表達的基礎上,進一步聯合使用褐藻素處理,結果顯示褐藻素可使氧化應激反應明顯減弱,證實其對Keap1/Nrf2/HO-1通路的調控作用。

綜上,Keap1/Nrf2/HO-1通絡介導前列腺癌DU145細胞氧化應激反應,而褐藻素可通過激活Keap1表達,進而抑制Nrf2、HO-1表達,促進氧化還原態平衡,誘導細胞凋亡,為臨床前列腺癌治療提供實驗依據。