CLOCK氧化還原修飾介導內源性H2O2對小鼠細胞呼吸的調節作用

常薇薇，李勛凱，張祝琴，陳厚早，劉德培

中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 醫學分子生物學國家重點實驗室生物化學與分子生物學系，北京 100005

細胞呼吸通過一系列化學反應將葡萄糖分解產生大量三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)和還原電子載體還原型輔酶Ⅰ(nicokinamide adenine dinucleotide, reduced, NADH)和還原黃素腺嘌呤二核苷酸(flavine ademine dinucleotide, reduced,FADH2)為細胞供能[1-2]。細胞呼吸過程同時也產生過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2),其水平受到生物體內氧化還原系統的控制[3]。內源性H2O2是細胞內重要的信號分子,但其是否可以反饋調節細胞呼吸目前依舊未知。

生物鐘是生物體為了適應環境節律性變化而進化出的保守內在計時機制,調節細胞呼吸等多種細胞功能。其核心分子晝夜節律運動輸出周期蛋白(circadian locomalor output cycles kaput,CLOCK)缺失會導致肝臟和肌肉線粒體呼吸鏈受損或ATP合酶表達下降[4],但CLOCK翻譯后修飾對細胞呼吸的調節尚不明確。研究發現,CLOCK半胱氨酸195位點可以直接被內源性H2O2氧化修飾并影響下游基因表達[5]。本文利用ClockC195S細胞,探究CLOCK的氧化還原修飾介導內源性H2O2對細胞呼吸的調節作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠:C57BL/6JClockwt和ClockC195S由北京唯尚立德生物科技有限公司提供。

1.1.2 材料:DMEM高糖培養基,PBS(賽維爾生物科技公司);0.25%胰蛋白酶(北京雷根生物技術公司);胎牛血清(GE Healthcare公司);NAD/NADH定量試劑盒(Sigma-Aldrich公司);增強型ATP檢測試劑盒、蛋白酶抑制劑(碧云天生物技術有限公司);細胞線粒體壓力檢測試劑盒、糖酵解檢測試劑盒、Seahorse XF Base Medium(Agilent Technologies公司);Trolox(MedChemExpress公司);Amplex? Red H2O2檢測試劑盒(Invitrogen 公司);CLOCK抗體(Cell Signaling Technology公司);Biotin-conjugated iodoacetamide, BIAM (Molecular Probes公司); Amicon? Ultra-15 離心過濾裝置(Merck公司)。……