乳粉中克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）能力驗證PCR技術的探索

仇平平　田夢　孫巧巧

摘 要：為提高實驗室檢測克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）的能力，本文依據NIFDC-PT-384乳粉中克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗能力驗證作業指導書、GB 4789.40-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗 》，探索傳統生化方法和PCR技術相結合的檢測克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）的方法。結果表明，樣品CODE12未檢出克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌），樣品CODE19檢出克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌），結果均為滿意。本實驗室具備檢驗克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）的能力，PCR技術很好地印證了傳統生化實驗的結果。

關鍵詞：乳粉，克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌），能力驗證，PCR技術

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-5944.2023.16.028

0 引言

克羅諾桿菌屬（Cronobacter spp.）是腸桿菌科內一類短桿狀革蘭氏陰性菌，1980 年以前被稱為“產黃色素陰溝腸桿菌（yellow-pig mented Enterobacter cloacae）”，1980 年更名為阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii），2008年被重新定義為一個新屬，即克羅諾桿菌屬[1-2]。國家食品安全標準GB4789.40-2016也做了相應調整，由“阪崎腸桿菌”更名為“克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）”。阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii）是一種條件致病菌，主要傳播媒介是奶粉，6月齡以下嬰兒是克羅諾桿菌屬的易感人群。嬰兒感染該菌后會引起菌血癥、腦膜炎、壞死性小腸結腸炎等，致死率高達40%-80%[3-5]。針對嬰幼兒食品的安全要求，國家食品安全標準GB 29921-2021《食品安全國家標準 預包裝食品中致病菌限量》中明確規定，嬰兒（0～6月齡）配方食品、特殊醫學用途嬰兒配方食品中克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）不得檢出。

近些年，克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）的檢測技術也在快速發展，其中以PCR檢測技術發展最快[ 7- 8 ]。目前，克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）的檢測主要是以傳統生化培養法為主，如何將PCR技術和傳統生化培養法結合起來應用到日常工作中是本實驗設計PCR實驗的出發點。參照SN/T 1632.2-2013《出口奶粉中克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗方法 第2部分：PCR方法》合成阪崎腸桿菌特異性引物SAFA-F、SAFA-R，參照《中國藥典》2020年版四部1021合成16SrRNA通用引物16SV1F、16SV3R，進行PCR擴增，查看凝膠電泳結果，將PCR產物送至第三方機構測序，測序結果在美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI）數據庫比對尋找同源微生物，與傳統生化培養法結果比較，以期可以將PCR技術和傳統生化培養方法有效結合起來，保證檢測結果的準確可靠。

1 材料

1.1 樣品

樣品由中國食品藥品檢定研究院提供，2份待測樣品，每份樣品包含裝有菌球的西林瓶1瓶和相同編碼的乳粉1袋（規格：100克/袋），2份樣品分別編號為：CODE12和CODE19。

1.2 培養基及試劑

緩沖蛋白胨水（BPW）、改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（mLST）基礎及配套添加試劑萬古霉素、阪崎腸桿菌顯色培養基（DFI瓊脂）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）干制生化鑒定試劑盒、氧化酶試紙及試劑、DNA提取裂解液，以上均采購于北京陸橋技術股份有限公司。

引物SAFA-F：GGGTTGTCTGCGAA GCGAA，SAFA-R：GTCTTGTGCTG CGAGTTTG；引物16SV1F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；引物16SV3R：GTATTACCGCGGCTGCTGGC（均由金唯智生物科技有限公司合成）。Premix Taq（TaKaRaTaqTM Version 2.0 plus dye）（品牌：TaKaRa），DL1000 DNA Marker（品牌：TaKaRa），瓊脂糖（品牌：IOWESTR），5×TBE緩沖液（品牌：SolarbioR），GelRedR Nucleic Acid Gel Stain核酸染色劑（品牌：BIOTIUM）。

1.3 儀器設備

無菌均質器（上海德記行科技發展公司）、DHP-9162B電熱恒溫培養箱（上海一恒儀器）、SPL -2 50生化培養箱（天津市萊波特瑞儀器）、VITEK2全自動微生物分析系統（梅里埃）、H1650R臺式高速冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器）、SVCJ-2G型雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設備）、T100定性PCR儀（品牌：伯樂BIO-RAD）、Powerpac Universa l通用電泳儀（品牌：伯樂BIO-RAD）、GelDoc EZ凝膠成像分析系統（品牌：伯樂BIORAD）。

1.4 標準菌株

阪崎腸桿菌 ATCC29544。

2 實驗方法

2.1 樣品處理

在生物安全柜內打開樣品菌球的西林瓶，將西林瓶內的小球加入到盛有900 mL滅菌緩沖蛋白胨水（BPW）的無菌均質袋中，充分溶解。然后再將與西林瓶相同編碼的乳粉樣品加入到上述緩沖蛋白胨水（BPW）中，充分混勻，作為樣品勻液。以阪崎腸桿菌標準菌株為陽性對照。

2.2 前增菌、增菌和PCR實驗

2.2.1 前增菌

將上述樣品勻液置于電熱恒溫培養箱中36 ℃培養18 h。

2.2.2 增菌

移取上述培養物1 mL轉種于10 mL改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素（mLST-Vm）肉湯中，混勻，44 ℃培養24 h。

2.2.3 菌液提取DNA模板進行PCR實驗

（1）菌液提取DNA。取前增菌液1 mL于1.5 mL離心管中，3000×g離心10 min，棄去上清，加入200 μL裂解液，渦旋混勻，沸水浴裂解10 min，冷卻后12000×g離心2 min，取上清即為模板。

（2）特異性引物PCR擴增。反應體系Premix Taq（TaKaRa TaqTM Version 2.0 plus dye） 25 μL，DNA模板2 μL，引物SAKA-F和引物SAKA-R（10 μmol/L）各1 μL，加無菌無酶水至總體積50 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進行35個循環；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

（3）凝膠電泳。用電泳緩沖液1×TA E制備1%瓊脂糖凝膠（冷卻至50 ℃左右加入GelRedR Nucleic Acid Gel Stain核酸染色劑），取PCR產物點樣，用DL1000DNA Marker做參照。3 V/cm～5 V/cm恒壓電泳，電泳30 min～60 min，用凝膠成像分析系統觀察并記錄結果。

（4）測序。將擴增出目標條帶的PCR產物送至金唯智生物科技有限公司測序，測序結果在NCBI網上數據庫進行比對。

2.3 分離

上述mLST-Vm肉湯培養物，輕搖混勻，用接種環取1環，劃線接種于阪崎顯色培養基平板上，平行劃線接種兩個平板，36 ℃，培養24 h。

挑取5個可疑菌落，劃線接種于TSA平板上，25 ℃，培養48 h。

2.4 鑒定

挑取TSA平板上黃色可疑菌落，選用商品化的生化鑒定試劑和梅里埃VIKE2全自動微生物分析系統上機鑒定進行生化鑒定。

菌落提取DNA模板：用接種環取一環純化后的菌落，溶于200 μL裂解液中，渦旋混勻，沸水浴裂解10 min，冷卻后12000×g離心2 min，取上清即為模板。

16?S通用引物PCR 擴增：反應體系Premix Taq（TaKaRa TaqTM Version 2.0 plus dye）25 μL，DNA模板2 μL，引物16S1VF和引物16SV3R（10μmol/L）各1 μL，加無酶無菌水至總體積50 μL。反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，進行30個循環；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。凝膠電泳和測序同2.2.3。

3 結果與分析

3.1 生化鑒定結果

采用商品化生化鑒定試劑盒和梅里埃VIKE2全自動微生物分析系統進行鑒定，本次能力驗證CODE12未檢出克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌），CODE19檢出克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌），與中檢院的標準結果一致，結果滿意。

在阪崎腸桿菌顯色平板上，克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）呈現藍-綠色，如圖1（a）、（b）、（c）所示，CODE12為無色菌落，CODE19和陽性對照均有藍-綠色菌落。

在TSA平板上，阪崎腸桿菌可以產生黃色素。結果顯示，CODE12在TSA平板上為無色菌落，CODE19藍-綠色菌落轉種后在TSA平板上為黃色菌落，CODE19黑色菌落轉種后在TSA平板上為無色菌落，陽性對照在TSA平板上為黃色菌落。

克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）干制生化鑒定試劑盒鑒定結果顯示，CODE12無色菌落和CODE19黑色菌落不符合阪崎腸桿菌生化反應，CODE19藍綠色菌落和陽性對照符合阪崎腸桿菌生化反應。結合上述結果可以判定CODE19檢出克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌），CODE12未檢出克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）。

梅里埃VIK E2全自動微生物分析系統上機鑒定結果見表1，CODE12鑒定為大腸埃希菌（Esch.coli），CODE19藍-綠色菌落（CODE19-1）鑒定為阪崎腸桿菌（Cro. sakazakii），CODE19黑色菌落（CODE19 -2）鑒定為奇異變形桿菌（Proteusmirabilis）。

3.2 PCR擴增結果

本實驗從兩個角度設計PCR實驗：第一，從增菌培養物中提取DNA，因有背景菌的干擾，選用阪崎腸桿菌特異性引物SAKA-F、SAKA-R進行PCR擴增目的片段（282 bp左右），如圖2所示泳道1-4，泳道1是以CODE12菌液DNA為模板，泳道2是以CODE19菌液DNA為模板，泳道3是以阪崎腸桿菌菌液DNA為模板，泳道4是陰性對照；第二，從純化后的TSA平板上單菌落提取DNA，選用細菌16SrRNA通用引物16S1VF、16SV3R進行PCR擴增目的片段（500 bp左右），如圖2所示泳道6-11，泳道6是以CODE12菌落DNA為模板，泳道7是以CODE19藍-綠色菌落DNA為模板，泳道8是以CODE19黑色菌落黑色部分DNA為模板，泳道9是以CODE19黑色菌落無色部分DNA為模板，泳道10是以阪崎腸桿菌菌落DNA為模板，泳道11是陰性對照。

將全部有條帶擴增出來的PCR產物送至金唯智生物科技有限公司測序，進一步確定微生物種類。

測序結果放到NCBI數據庫進行菌株的同源性比對，一致度越高說明與該菌株同源性越接近，見表2，CODE12（編號6）與大腸埃希菌同源性接近，CODE19（編號2和編號7）與克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）同源性接近，結合生化鑒定結果進行判定。

4 討論

在分離鑒別克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）時，阪崎腸桿菌顯色培養基比較關鍵。阪崎腸桿菌含有α-葡萄糖苷酶，可特異性分解5-溴-4氯-3-吲哚-α-D-吡喃葡糖甙使菌落呈現藍-綠色[9]。此次能力驗證提供的兩份樣品，CODE12只有一種無色菌落形態，CODE19不僅有藍-綠色菌落還有黑色菌落（無色菌落有黑色中心）。識別和排除非目標菌的干擾可以有效考核能力驗證參與者的水平。本實驗采用傳統生化鑒定方法和PCR技術分別對黑色菌落進行了進一步的鑒定，最終鑒定為奇異變形桿菌。

能力驗證檢品菌落特征一般都比較典型，容易區分不會弄錯，但在實際工作中食品樣品中菌種未知且復雜，未知菌的確證鑒定也比較煩瑣，需要多方驗證方知微生物種類，本實驗提供的PCR實驗思路，可以有效印證傳統生化實驗的結果。

5 結論

本實驗室按照GB 4789.40-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗 》開展試驗，CODE12未檢出克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌），CODE19檢出克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌），結論為滿意，順利通過本次能力驗證。本次設計的PCR實驗達到預期效果，與GB 4789.40-2016結果相吻合。由此可見，PCR技術可以很好地應用到食品克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗中去，兩相結合可以提高檢驗結果的準確性。

參考文獻

[1]IVERSEN C， LEHNER A， MARUGG J， et al. Identification of “Cronobacter”spp. （Enterobacter sakazakii ）[J] . Journal of Clinical Microbiology ， 2007， 45（11）： 3814-3816.

[2]馬炳存，陳學強，王燦，等.即食食品中阪崎克羅諾桿菌的分離鑒定及分子分型[J].中國食品學，2022，22（3）：273-280.

[3]HENRY M，FOULADKHAH A. Outbreak history，biofilm for mation ， and preventive measures for control of Cronobacter sakazakii in infant formula and infant caresettings[J]. Microorganisms，2019，7（3）：77.

[4]NAZAROWEC-WHITE M，FARBER J M. Enterobacter sakazakii：a review[J]. International Journal of Food Microbiology，1997，34（2）：103-113.

[5]王彥人，焦敬波，張鈞森，等. LAMP在阪崎克羅諾桿菌檢測中的研究進展[J].食品與生物技術學報，2022，41（2）：1-7.

[6]周露，馬蓉.食品中阪崎腸桿菌能力驗證結果分析與探討[J].綠色科技，2017 （18）：224-226.

[7]張清平，張懿翔，劉洋.嬰幼兒奶粉中阪崎腸桿菌增菌培養對PCR快速檢測的影響[J].中國乳品工業，2021（11）： 9-12.

[8]陳燕.16S rDNA技術在乳粉阪崎腸桿菌監測中的應用[J].中國乳品工業，2016，44（7）：20-22.

[9]于瑞莉，鄒鳳，任靜，等.克羅諾桿菌屬顯色培養基的研究[J].中國衛生檢驗雜志，2022，32（6）：683-685+689.

作者簡介

仇平平，碩士研究生，工程師，研究方向為食品藥品微生物檢測。

田夢，碩士研究生，工程師，研究方向為食品藥品微生物檢測。

孫巧巧，本科，主管藥師，研究方向為食品藥品微生物檢測。

（責任編輯：袁文靜）