濕寒證對絕經后骨質疏松癥模型大鼠下丘腦弓狀核β-EP的影響

陳媛鑫， 阿衣努爾·買提斯迪克， 劉闐生， 買買提明·努爾買買提, 劉 凱

(1新疆醫科大學維吾爾醫學院， 烏魯木齊 830017； 2新疆醫科大學第一附屬醫院骨科顯微修復外科， 烏魯木齊 830054)

絕經后骨質疏松癥(Postmenopausal osteoporosis,PMOP)是絕經后婦女由于雌激素缺乏發生骨代謝失衡、骨量低為主要特征的全身代謝性疾病[1]。骨代謝機制極復雜，在防治PMOP方面存在諸多爭議，需進一步研究闡明其發病機制。下丘腦作為神經內分泌調節的中樞，參與調控PMOP[2]。弓狀核為下丘腦神經分泌系統中重要的核團，通過多途徑調控骨代謝[3]，弓狀核β-EP則是調控骨代謝的重要途徑[4]。課題組前期研究發現濕寒證可造成大鼠骨密度降低，骨折應力及楊氏模量下降，骨代謝尿指標鈣、磷、I型膠原交聯N-末端肽、I型膠原交聯C-末端肽等處于紊亂狀態[5]。進一步研究發現，濕寒證模型組大鼠血清中腎上腺皮質激素、皮質酮較正常對照組升高，下丘腦、垂體、腎上腺細胞器有不同程度的改變，提示濕寒證模型組的下丘腦-垂體-腎上腺軸可能處于應激中[6]。本研究在前期研究的基礎上進一步研究濕寒證對下丘腦弓狀核β-EP表達的影響，探討濕寒證與弓狀核功能之間的關系，從弓狀核功能角度闡明濕寒證對骨質疏松癥(Osteoporosis，OP)發生發展的部分機制。

1 材料與方法

1.1 動物4月齡未交配的SPF級雌性SD大鼠，體重(240±10)g，購自新疆醫科大學實驗中心。生產許可證：SCXK(新)-2018-0002。倫審會批號：LACUC20190916-01。

1.2 主要試劑與儀器β- EP一抗購自美國Novus Biologicals公司；SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒等購自武漢博士德生物工程有限公司；抗體稀釋液購自中杉金橋公司；EDTA修復液購自北京索萊寶科技有限公司；徠卡攤片機、徠卡組織包埋機、徠卡石蠟切片機(德國徠卡微系統有限公司)；RQH-350型人工氣候箱(上海精宏實驗設備有限公司)。

1.3 寒涼性飼料制備將普通飼料、芫荽籽+菠菜籽按7∶3比例混合制備[5]，委托于江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司加工。

1.4 分組及造模

1.4.1 分組 將30只雌性SD大鼠按照隨機數字表法隨機分為5組，每組6只。依次設為正常對照組、假手術組、濕寒證模型組、OVX模型組、OVX+濕寒證模型組。正常對照組常規飼養，假手術組僅做假手術，濕寒證模型組加濕寒證病因因素，OVX模型組做OVX手術，OVX+濕寒證模型組做OVX手術加濕寒證病因因素。各組大鼠均自由攝食飲水。

1.4.2 造模 濕寒證模型的建立:參照文獻[6]將濕寒證模型組大鼠置于濕寒環境,設置環境溫度(6±1)℃，相對濕度85%～95%、寒涼性飼料喂養、冷水強迫游泳,水溫: (6±1)℃，1 d/次、持續 5 min聯合刺激24 d。骨質疏松癥模型的建立：對OVX模型組大鼠采用摘除雙側卵巢法，第9周建立OVX模型。假手術組大鼠僅切除卵巢周圍的脂肪組織。OVX+濕寒證模型的建立：參照文獻[5]對OVX+濕寒證模型組大鼠用濕寒證造模方法與骨質疏松癥造模方法聯合同時干預，第9周建立模型。

1.5 檢測指標

1.5.1 外觀表征的觀察 每周記錄各組大鼠的證候表征變化，包括鼻唇、舌、行為狀態、情緒反應、興奮程度、體重、飲食等。

1.5.2 大鼠骨密度和微結構參數 脛骨甲醛固定24 h后，乙醇脫水，甲醛處理，包埋；用Micro-CT測量骨密度和骨形態計量學參數。

1.5.3 病理切片 用HE法染色觀察下丘腦弓狀核病理變化，包埋，切片，染色。

1.5.4 弓狀核β-EP免疫反應陽性細胞數 使用SABC免疫組化法，參照試劑盒說明書進行操作，圖片采用FIJI8.0圖形分析軟件分析，取其平均值進行統計分析。

2 結果

2.1 實驗動物外在表征與正常對照組比，濕寒證模型組大鼠體型臃腫，鼻部潮濕，舌體胖大，舌苔白膩，蜷臥少動，尿色清、尿量明顯增多，大便塘稀，體重增長緩慢，攝食量增加，飲水量減少，但總體呈上升趨勢，呈現濕寒證候表征。見圖1～3。

圖1 正常對照組和濕寒證模型組大鼠攝水量比較

圖2 正常對照組和濕寒證模型組大鼠攝食量比較

圖3 正常對照組和濕寒證模型組大鼠體重增長比較

2.2 大鼠脛骨骨密度和微結構變化與正常對照組相比OVX模型組骨密度降低，差異有統計學意義(P<0.05)，其中骨體積百分比下降、骨小梁分離度上升，結構模型指數升高，差異有統計學意義(P<0.05)，表明骨微結構受到破壞，有差異性改變，OVX造模成功。與OVX模型組相比，OVX+濕寒證模型組骨密度下降(P>0.05)，但骨小梁分離度上升、骨小梁分離度標準差、結構模型指數上升，差異有統計學意義(P<0.05)，表明骨微結構有改變。見表1。

2.3 大鼠下丘腦HE染色病理結果正常對照組大鼠下丘腦在低倍鏡下可見弓狀核區域神經元形態結構完好，神經元細胞數量均勻，組織結構致密，細胞間空隙較小，細胞核形態排列規則，細胞界限清晰(圖4A)。濕寒證模型組細胞核形態排列不規則(圖4B)，下丘腦基質疏松，開始出現部分細胞界限不清晰，核顏色加深(圖4C)。OVX模型組弓狀核區域出現明顯的神經元壞死，胞質嗜酸性增強，細胞核固縮、溶解、消失，組織結構變疏松，細胞間空隙變大，呈現空隙狀(圖4D)。OVX+濕寒證模型組神經元細胞大面積凋亡，細胞界限不清，組織結構疏松，細胞間出現大面積空隙(圖4E)。

2.4 大鼠下丘腦弓狀核β-EP免疫反應陽性細胞數變化β-EP著色于胞漿呈黃色或棕黃色的顆粒。生理狀態下下丘腦β-EP免疫反應陽性細胞呈高表達(圖6A)，與正常對照組比，濕寒證模型組β-EP免疫反應陽性細胞數量明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與正常對照組對比，OVX模型組β-EP免疫反應陽性細胞數量明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與OVX模型組對比，OVX+濕寒證模型組β-EP免疫反應陽性細胞數量明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5、6。

表1 各組大鼠脛骨骨密度和微結構參數

注：A,正常對照組;B,假手術組;C,濕寒證模型組;D,OVX模型組;E,OVX+濕寒證模型組。

注：與正常對照組(A)比較, △P<0.05; 與假手術組(B)比較, ▲P<0.05; 與濕寒證模型組(C)比較, #P<0.05; 與OVX模型組(D)比較, *P<0.05。

注：A,正常對照組;B,假手術組;C,濕寒證模型組;D,OVX模型組;E,OVX+濕寒證模型組(箭頭示陽性細胞)。

3 討論

中醫病證結合模型是按中醫基礎理論復制，同時疊加現代醫學疾病的模型[7]。本研究加入中醫濕寒證致病因素，再聯合OVX手術建立絕經后骨質疏松濕寒病證大鼠模型。本研究結果顯示濕寒證模型組、OVX+濕寒證模型組加入濕寒證候病因，所構建的濕寒證大鼠模型，其外在表征與濕寒證臨床癥狀基本相似。

中醫理論認為腦具有調控骨的作用，“髓充骨養腦”和“腦-骨”軸為抗OP機制提供了新思路[8]。人體在低溫環境下可激活中樞應激系統，改變應激因子和神經遞質[9]。故濕寒證可引起下丘腦神經元細胞組織形態學改變，濕寒證可影響并加重其凋亡。β-EP是由弓狀核前阿片黑皮質素裂解生成的神經肽，可被釋放進入腦脊液影響大腦區域，作用于中樞神經系統[10]。β-EP對食物攝入量的長期調節是中度抑制，限制了食物的消耗[11]，故濕寒證模型組大鼠β-EP下降后，攝食量較正常對照組增加。β-EP產生的欣快感和幸福感使大鼠活躍，大鼠長期或反復受約束應激會減少β-EP作用在下丘腦μ-阿片受體的表達，出現整體應激反應，故濕寒證組β-EP降低后出現蜷臥少動的狀態改變；β-EP受體的配體介導了骨系統中的生物效應，包括骨礦化、骨保護和免疫調節，通過能量代謝的相互作用參與骨骼形成。有研究表明，可通過抑制NF-κB信號通路，降低破骨細胞活性，從而預防或治療OP[12]。β-EP可通過減少NF-κB信號通路下游的I-κBα和p65蛋白的磷酸化水平，從而調控NF-κB通路[13]。有研究表明，提高β-EP水平可調節骨代謝[14]?？梢姦?EP在OP的形成中發揮重要的調節作用。

本研究結果提示濕寒證是影響β-EP表達水平下降的原因，與正常對照比，濕寒證模型組β-EP表達下降，與OVX模型組比，OVX+濕寒證模型組β-EP表達較減少更為明顯。環境因素對PMOP的形成密切相關，寒冷環境對骨密度影響較大，易造成骨量丟失，加速OP進程[15]。與OVX組比，OVX+濕寒證模型組骨密度下降更顯著。本研究認為濕寒證可使下丘腦弓狀核β-EP表達水平下降，而β-EP可調節骨代謝，故濕寒證可引起骨密度下降。本研究結果指出濕寒證可能是通過弓狀核神經元形態結構改變及β-EP表達水平下降，導致絕經后大鼠骨密度減少、骨微結構改變,從而誘發OP的發生發展。β-EP可能是一個潛在的治療靶點，通過調控β-EP表達水平從而預防OP。本研究闡明了濕寒證與β-EP的內在聯系，為防治OP提供了新思路。但本研究樣本量小，也沒有相關信號通路的支持，今后的研究，應開展大樣本并加入信號通路的檢測，以期為中醫藥治療OP提供更多理論依據。