響應面法優化抑菌洗液提取工藝的研究

彭一峰， 李文慧， 來海中， 孫琰琴,4， 徐建軍， 張 薇， 羅恒磊， 冀祖恩,

(1新疆全安藥業股份有限公司； 2新疆甘草及制品研究重點實驗室， 新疆 庫爾勒 841000； 3中國科學院新疆理化技術研究所， 烏魯木齊 830011；4新疆凱美嘉生物科技有限公司， 新疆 昌吉 831100; 5新疆環拓生物科技有限公司， 烏魯木齊 830011)

抑菌洗液是由苦參、百部、黃柏、蛇床子、醋酸氯己定、甘草總黃酮組成，具有清熱解毒，燥濕止帶的功效，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌病原微生物引起的婦科炎癥有較好的抗菌消炎作用，臨床多用于私處清潔和日常衛生護理[1-3]。中藥材在治療陰道炎癥方面積累了豐富的經驗，在菌群平衡方面具有明顯優勢[4-6]。本研究采用響應曲面法優化抑菌洗液的提取工藝，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備LMQC-80E型立式滅菌器(山東新華醫療器械股份有限公司)，SPX-150型生化培養箱(上海金慧科電子有限公司)；ZHJH-C1112B型超凈工作臺(上海智誠分析儀器制造有限公司)。

1.2 藥材與試劑藥材苦參、百部、黃柏、蛇床子均在2020年9月采購于新疆維草集藥材有限公司，由新疆全安藥業有限公司趙向英藥師鑒定為豆科植物苦參(SophoraflavescensAit.)、百部科植物直立百部[Stemonasessilifolia(Miq.)]、蕓香科植物黃皮樹(PhellodendornChinense Schneid.)、傘朵科植物蛇床[Cnidiummonnieri(L.)Cuss.]。甘草總黃酮(新疆全安藥業股份有限公司，批號：D2022001)。金黃色葡萄球菌(蘇州大禧生物科技有限公司，批號：CMCCB26003)，大腸桿菌(蘇州大禧生物科技有限公司，批號：CMCCB44102)，白色念珠菌(蘇州大禧生物科技有限公司，批號：CMCCF98001)。

2 方法

2.1 單因素試驗設計以抑菌洗液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌抑菌圈直徑大小來判斷抑菌效果為指標，固定其他工藝條件，依次改變煎煮提取時間(1、2、3、4、5、6 h)、煎煮次數(1、2、3、4、5、6 次)、液料比(v∶m,6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、11∶1)進行測定。

2.2 抑菌實驗測定采用梯度稀釋比濁法，將白念珠菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌配成106 CFU/mL的菌懸液備用。取上述菌懸液0.2 mL分別涂布在相應的胰酪大豆胨瓊脂培養基，取經滅菌直徑為 5.5 mm的圓形濾紙片，每片滴加抑菌洗液5 μL，以生理鹽水為對照組，在37℃的環境下，將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養基培養24 h；在28℃的環境下，將白色念珠菌培養基培養48 h。測量抑菌圈的直徑，重復測定3次，取平均值。

2.3 響應面試驗設計依據Box-Behnken實驗設計原則，在前期單因素實驗結果基礎上，選取對抑菌洗液中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌等抑菌圈直徑大小影響較大的3個因素：液料比，煎煮次數和煎煮提取時間，各取3個水平分別記為水平-1、0、1，進行因素水平共17個試驗點的響應曲面分析試驗，并運用數據統計分析軟件進行數據分析，進而得到最佳抑菌洗液中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌抑菌效果的條件，見表1。

表1 3因素3水平響應曲面分析實驗設計表

3 結果

3.1 單因素實驗結果

3.1.1 煎煮提取時間對抑菌洗液抑菌效果的影響 當煎煮提取時間為2 h時，抑菌洗液對大腸桿菌抑菌圈直徑為8.30 mm，對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為21.56 mm，對白色念珠菌抑菌圈直徑為12.00 mm。因此確定煎煮提取時間為2 h，見表2。

表2 煎煮提取時間對抑菌效果的影響

3.1.2 煎煮次數對抑菌洗液抑菌效果的影響 當煎煮提取次數為2次時，抑菌洗液對大腸桿菌抑菌圈直徑為9.89 mm，金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為19.90 mm，白色念珠菌抑菌圈直徑為10.90 mm。因此確定煎煮提取次數為2次，見表3。

表3 煎煮次數對抑菌效果的影響

3.1.3 液料比對抑菌洗液中抑菌效果的影響 液料比為8倍時，抑菌洗液對大腸桿菌抑菌圈直徑為8.85 mm，金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為22.40 mm，白色念珠菌抑菌圈直徑為11.30 mm。因此確定液料比值為8倍，見表4。

表4 液料比對抑菌效果的影響

3.2 響應面設計及結果

3.2.1 響應面實驗設計 在單因素試驗結果基礎上，選擇影響較大的3個因素：煎煮提取時間和煎煮次數，液料比，各取3個水平分別記為水平-1、0、1，進行因素水平共17個試驗點的響應曲面分析試驗，采用抑菌實驗測定大腸桿菌抑菌環直徑、金黃色葡萄球菌抑菌環直徑、白色念珠菌抑菌環直徑大小來判斷抑菌效果，直徑越大抑菌效果越好，見表5。

表5 響應曲面優化抑菌洗液抑菌效果實驗設計與結果

3.2.2 響應面實驗數據 運用Design expert 10.0數據分析軟件對試驗數據進行多元回歸擬合，設液料比、煎煮次數和煎煮提取時間分別為A、B、C，分別以抑菌洗液中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌抑菌效果為響應值進行多元回歸擬合，得到二次多項回歸模型如下：

3.2.4 各因素的交互作用 一次項液料比倍數、煎煮次數、煎煮提取時間對抑菌洗液中大腸桿菌抑菌效果均具有極顯著影響(P<0.01)，大腸桿菌中各因素的主效應關系為：B>C>A，即煎煮次數>煎煮提取時間>液料比。金黃色葡萄球菌抑菌效果分析各因素的主效應關系為：C>B>A，即煎煮提取時間>煎煮次數>液料比。白色念珠菌抑菌效果分析各因素主效應關系為：C>A>B，即煎煮提取時間>液料比>煎煮次數，見圖1-9。

表6 抑菌洗液中大腸桿菌抑菌效果模型及回歸系數的回歸分析結果

表7 抑菌洗液中金黃色葡萄球菌抑菌效果模型及回歸系數的回歸分析結果

表8 抑菌洗液中白色念球菌抑菌效果模型及回歸系數的回歸分析結果

3.3 驗證試驗結果根據回歸方程模型結合響應面，得到預測的最優條件為：液料比為7.909倍、煎煮次數為2.574次、煎煮提取時間為2.593 h。根據實際操作，將實驗條件修正為液料比為8倍、煎煮次數為2次、煎煮提取時間為2.5 h，證實了預測值和實驗值之間的良好相關性，表明試驗模型可靠。根據重復性實驗且工藝穩定，因此適用于優化抑菌洗液的工藝提取。優化后的抑菌洗液提取工藝對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的抑菌效果更好，見圖10-12。

圖2 液料比(A)、提取時間(C)交互作用對大腸桿菌抑菌效果的響應圖和等高線

圖3 提取次數(B)、提取時間(C)交互作用對大腸桿菌抑菌效果的響應圖和等高線

圖4 液料比(A)、煎煮次數(B)交互作用對金黃色葡萄球菌抑菌效果響應圖和等高線

圖5 液料比(A)、提取時間(C)交互作用對金黃色葡萄球菌抑菌效果的響應圖和等高線

圖6 提取次數(B)、提取時間(C)交互作用對金黃色葡萄球菌抑菌效果的響應圖和等高線

圖7 液料比(A)、煎煮次數(B)交互作用對白色念珠菌抑菌效果的響應圖和等高線

圖8 液料比(A)、提取時間(C)交互作用對白色念珠菌抑菌效果的響應圖和等高線

圖9 提取次數(B)、提取時間(C)交互作用對金黃色葡萄球菌抑菌效果的響應圖和等高線

注：1，2，3為響應面設計中實驗組，4為優化工藝實驗組。

注：1，2，3為響應面設計中實驗組，4為優化工藝實驗組。

注：1，2，3為響應面設計中實驗組，4為優化工藝實驗組。

4 討論

超聲提取[7-9]、微波提取[10]、超臨界流體提取等[11]新型藥材提取方法，設備相對昂貴，提取成本較高。結合抑菌洗液中苦參、百部、黃柏、蛇床子等中藥材理化性質及生產成本方慮，采煎煮法進行工藝提取，具有成本較低、操作簡單、無溶劑殘留等優點[12-15]，提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌等病原微生物有較強抑制作用。本研究采用響應面法優化抑菌洗液提取工藝，工藝穩定，簡單可行，為抑菌洗液的工藝提取發展提供了理論依據。