甘草酸及其制劑抗新冠感染作用機制研究進展

高曉黎， 王子航， 單 宇， 謝湘云,2， 常占瑛,2， 王 梅

(1新疆醫科大學藥學院； 2新疆及中亞特色醫藥資源教育部工程研究中心； 3新疆天然藥物活性組分與釋藥技術重點實驗室， 烏魯木齊 830017)

2019年12月，中國湖北省武漢市報告了不明微生物引起的病毒性肺炎。2020年1月3日，中國國家病毒疾病控制和預防研究所(IVDC)的科學家通過結合Sanger測序、Illumina測序和納米孔測序鑒定出新的人類感染冠狀病毒[1]。國際病毒分類委員會將該病毒命名為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒 2(Severeacute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)[2]，世界衛生組織將其引起的肺炎定義為Corona Virus Disease 2019 簡稱 COVID-19[3]。由于 COVID-19具有較強的傳染性并造成較大范圍的傳播，世界衛生組織宣布新冠肺炎構成國際關注的突發公共衛生事件[4]。2022年12月26日，國家衛生健康委員會發布公告，將新型冠狀病毒肺炎更名為新型冠狀病毒感染，簡稱新冠感染。

以中藥甘草中活性成分三萜類化合物為主藥研發上市的制劑，主要有甘草甜素片、復方甘草酸苷片、復方甘草酸苷注射液、復方甘草酸單銨S注射液以及對其分離α單體為主成分的甘草酸二銨腸溶膠囊和異甘草酸鎂注射液等。由于甘草酸類制劑具有抗炎癥作用、免疫調節作用(對T細胞活化的調節作用；對γ干擾素的誘導作用；活化NK細胞作用；促進胸腺外T淋巴細胞分化作用)、對實驗性肝細胞損傷的抑制作用，甘草酸苷有抑制由四氯化碳所致的肝細胞損傷作用、抑制病毒增殖和對病毒的滅活等藥理作用，在2003 年曾作為治療嚴重急性呼吸綜合征(Severe acute respiratory syndrome，SARS)有效藥物參與臨床的治療。Cinatl等[5]分離了德國法蘭克福大學臨床中心SARS患者的冠狀病毒，體外對比分析了利巴韋林、6-氮尿苷、吡唑呋喃菌素、麥考酚酸和甘草酸苷抗嚴重急性呼吸綜合征樣冠狀病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)活性，結果顯示甘草酸苷能夠顯著抑制SARS-CoV復制，且在病毒復制早期能抑制病毒吸附和侵入宿主細胞，其抗SARS-CoV活性最強。

2003年SARS疫情之后國內外學者對甘草酸苷用于SARS-CoV及其他病毒的有效性與抗病毒機制開展了研究，邱振寧對此發表綜述[6]。根據這些研究基礎，2020年楊磊等[7]進行了“復方甘草酸苷治療新型冠狀病毒肺炎的可行性分析”的研究。2020年4月，中國藥學會醫院藥學專業委員會特組織臨床和藥學專家，參考國內外最新的診療方案和研究成果，并結合國內各地新冠感染患者的救治經驗，制定出《新型冠狀病毒肺炎臨床合理用藥專家共識》中指出口服甘草酸二銨+維生素C可用來防治新冠感染導致的細胞因子風暴[8]。空軍軍醫大學西京醫院重癥醫療隊建議“新冠感染合并急性肝損傷時可使用甘草酸類制劑抗炎保肝”[9]。與此同時，新冠感染疫情發生以來，國內外學者對甘草酸及其相關制劑抗新冠感染的作用機制開展了一系列研究，以期從天然產物中尋找有效的治療藥物，為甘草酸類藥物制劑治療新冠感染提供理論依據。

1 SARS-CoV-2分子生物學特點

SARS-CoV-2屬于 β- 冠狀病毒[10]，單鏈基因組RNA為29 891個核苷酸，編碼9 860個氨基酸，G+C含量為38%，其基因組包含兩個非翻譯區和一個編碼多蛋白的長開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)，并按照5’-復制酶-3’的順序排列[11]。ORF1a和ORF1b兩個主要ORF與核糖體框架移位重疊，包含基因組的三分之二，分別翻譯為多聚蛋白pp1a和pp1ab[12]，這些多聚蛋白經病毒蛋白酶加工，產生非結構蛋白(Nonstructural，Nsps)，Nsp1 至 Nsp16[13]。Nsps 和一些宿主因子在雙膜囊泡內形成復制轉錄復合物，是病毒基因組復制和轉錄的中心樞紐[14]。其余三分之一的基因組具有重疊的ORF，編碼四種主要結構蛋白：棘突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核衣殼蛋白(N)，以及一些輔助蛋白[15]。在病毒感染期間，SARS-CoV-2通過S蛋白與人類血管緊張素轉換酶2(Angiotensinconverting enzyme 2，ACE2)結合介導包膜與宿主細胞膜直接融合，將其基因組注射到宿主細胞中[16]。進入宿主細胞后，SARS-CoV-2未被包覆的向導RNA釋放到宿主細胞細胞質中，并由宿主核糖體翻譯。翻譯產物的多聚蛋白pp1a和pp1ab被病毒蛋白酶PLpro和Mpro蛋白水解成Nsp1-16并在宿主細胞內形成RTC進行復制與轉錄，RNA(+)鏈首先復制到RNA(-)鏈，然后負鏈用于復制到RNA(+)鏈以進行新病毒粒子組裝或轉錄亞基因組mRNAs，這些亞基因組mRNA被翻譯成結構蛋白S、M、E、N和輔助蛋白。S、M和E蛋白進入內質網，N蛋白附著在基因組RNA(+)鏈上，產生核蛋白復合物[17]。核蛋白復合物和結構蛋白移到內質網高爾基體中間區，病毒粒子在那里以小囊泡的形式聚集、成熟并從高爾基體萌發。這些囊泡進入宿主細胞膜，通過胞吐作用釋放到細胞外區域。釋放的病毒粒子感染一組新的細胞，導致疾病進展[18]。

2 新冠感染病理生理特點

新冠感染的癥狀與普通感冒相似，包括發燒、咳嗽和呼吸急促[19]，感染可導致肺炎， 《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第九版)》中論述“嚴重者可快速進展為急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)、膿毒血癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和出凝血功能障礙及多器官功能衰竭等”[20]。

2.1 肺部病理特征新冠感染病理學檢查結果顯示，雙肺纖維樣肺泡損傷與細胞黏液樣滲出物有關。右肺顯示明顯的肺細胞脫落和透明膜形成，提示ARDS。左肺組織表現為肺水腫伴透明膜形成，提示早期ARDS。雙肺間質內可見以淋巴細胞為主的單核細胞浸潤。肺泡內可見多核合胞體細胞，肺細胞不典型增大，其特征為細胞核大，嗜兩性顆粒細胞質，核仁突出，提示病毒性細胞病變樣改變[21]。

2.2 新冠感染導致ARDSARDS是一種危及生命的肺部疾病，阻止足夠的氧氣進入肺部和循環，導致大多數呼吸系統疾病和急性肺損傷的死亡[22]，在人類SARS-CoV-2感染的致命病例中，個體表現出需要機械通氣的嚴重呼吸窘迫，組織病理學結果也支持ARDS[23]。

2.3 免疫功能障礙在重癥新冠感染患者中，嗜酸性粒細胞減少和淋巴細胞減少以及 CD4+和 CD8+T 細胞、B細胞和自然殺傷細胞的嚴重降低是一個共同特征[24]。在感染后幾天內幾乎普遍檢測到病毒特異性IgM、IgG和IgA以及中和IgG抗體所證明觸發強烈的體液免疫反應[25]。

2.4 細胞因子風暴SARS-CoV-2引起的組織損傷導致促炎細胞因子的過度分泌和其他促炎細胞(如粒細胞和巨噬細胞)的募集，這導致細胞因子分泌和白細胞募集形成“瀑布效應”，導致全身炎癥反應，稱為巨噬細胞激活綜合征或繼發性噬血細胞性淋巴組織細胞增多癥，俗稱細胞因子風暴(Cytokine storm，CS)[26]。感染SARS-COV-2的患者血漿中出現以下情況：IL-1、IL-1RA、IL-7、IL-8、IL-10、IFN-γ、MCP-1、MIP-1α、G-CSF和TNF-α[27]，這些細胞因子升高的水平與疾病的嚴重程度相關。CS通過多途徑介導炎癥反應。

3 抗新冠感染的治療藥物

3.1 莫諾拉韋莫諾拉韋(Molnupiravir)由默沙東公司(默克)與Ridgeback生物治療公司共同開發。是一款廣譜抗病毒藥物。最初是針對委內瑞拉馬腦炎病毒而開發，后來被用于流感病毒、呼吸道輪狀病毒等多種病毒的治療。Molnupiravir的作用機制不是直接消滅或抑制病毒，而是誘導病毒RNA聚合酶和自己結合，進行錯誤復制(突變)，最終合成沒有感染性的假病毒。該藥物的作用機制決定了其需要在感染早期服用，才能取得較好的效果[28]。2022年12月29日，國家藥監局根據《藥品管理法》相關規定，按照藥品特別審批程序，進行應急審評審批，附條件批準默沙東公司新冠病毒治療藥物莫諾拉韋膠囊(商品名稱：利卓瑞/LAGEVRIO)進口注冊。莫諾拉韋是口服小分子新冠病毒治療藥物，能夠降低輕中度新冠感染患者的住院率及病死率[29]。

3.2 奈瑪特韋-利托那韋輝瑞開發的奈瑪特韋-利托那韋(商品名：Paxlovid)已在多個國家和地區獲得了治療新冠感染的緊急使用授權。Paxlovid是由利托那韋和奈瑪特韋組成的復合藥。利托那韋早就是一種抗艾滋病藥物，能夠破壞病毒中酶的正常功能，使病毒無法完成組裝和釋放。而奈瑪特韋則是新冠病毒主要蛋白酶Mpro的擬肽類抑制劑，能夠讓Mpro無法處理多蛋白前體，從而抑制新冠病毒在人體內的增殖[30]。Paxlovid被證明可降低輕中度新冠感染患者的住院風險與重癥新冠感染患者的死亡率[31]。

3.3 阿茲夫定2021年，阿茲夫定(Azvudine)作為抗艾滋病藥物獲批上市。2022年7月，阿茲夫定獲得國家藥監局緊急附加條件批準，成為中國緊急批準授權使用的國產抗新冠口服藥。阿茲夫定的作用機制和Molnupiravir相似，都是通過“誘騙”RNA病毒與自己結合來抑制病毒的復制[32]。Paxlovid以及阿茲夫定目前在中國臨床一線的用途主要有兩個：一是對高危人群進行干預用藥，二是用于重癥、危重癥感染者的抗病毒治療。

3.4 VV116VV116 是我國自主研發的對 SARS-CoV-2 具有強效活性的口服抗病毒藥，屬于 SARS-CoV-2的RNA復制酶小分子抑制劑。在III期臨床試驗中VV116在持續臨床康復時間、臨床癥狀恢復時間、新冠病毒轉陰時間均非劣于奈瑪特韋-利托那韋，且不良事件更少[33]。

3.5 羥氯喹羥氯喹具有廣譜抗病毒作用，并具有調節免疫的 功能，可以顯著下調多種炎癥因子的表達[34]。已在臨床用于抗新冠病毒的治療。但長期應用可導致嚴重錐體外系反應、抑制竇房結、心律失常等副作用[35]。

3.6 糖皮質激素糖皮質激素具有強效抗炎與免疫抑制作用，可能會降低新冠感染患者的死亡率，常用于患者氧合指標惡化或出現ARDS癥狀[36]。但其使用具有一定的爭議，較大劑量的糖皮質激素產生的免疫抑制作用會延緩機體清除新冠病毒并產生糖尿病、骨質疏松等不良反應。

3.7 托珠單抗新冠重癥感染患者可能會出現細胞因子風暴，促炎性細胞因子IL-6的生成可能是導致細胞因子風暴的重要途徑[37]。IL-6拮抗劑托珠單抗可用于IL-6水平升高的重癥患者。但其具有嚴重不良反應，包括致死性的超敏反應，且有活動性結核感染者禁用[38]。

4 甘草酸及其制劑抗新冠感染作用機制

甘草酸及其制劑可通過直接作用SARS-CoV-2產生良好的抗病毒作用；也可通過靶向宿主產生抗炎、類皮質激素樣作用和免疫調節作用，抑制細胞因子風暴，緩解免疫損傷導致的ARDS。

4.1 甘草酸及其制劑抗SARS-CoV-2作用機制

4.1.1 阻斷S蛋白 運用表面等離子共振技術發現甘草酸對SARS-CoV-2的S1亞單位表現出高度親和力并具有濃度依賴性，表明甘草酸可能通過影響S蛋白與人 ACE2 蛋白之間的相互作用而具有潛在的抗SARS-CoV-2活性。通過納米比特技術發現甘草酸在低濃度下破壞了SARS-CoV-2 S-RBD/ACE2的相互作用，表明甘草酸能有效抑制 SARS-CoV-2 S-RBD/ACE2相互作用[39]，并且甘草酸阻斷S蛋白結合超過95%[40]。甘草酸在Vero E6細胞中抑制了SARS-CoV-2的復制，并在高劑量時不表現出細胞毒性[41]。

4.1.2 調節跨膜絲氨酸蛋白酶2 跨膜絲氨酸蛋白酶2(Transmembrane protease serine 2，TMPRSS2)可以切割SARS-CoV-2的S蛋白，促進SARS-CoV-2與細胞膜的融合[42]。甘草酸可以抑制TMPRSS2的表達[43]，阻止SARS-CoV-2進入細胞。

4.1.3 結合Nsp-15 通過分子對接和分子動力學模擬發現甘草酸與SARS-CoV-2的Nsp-15內切核糖核酸酶的結合位點有強相互作用[44]，推測甘草酸可抑制SARS-CoV-2的 復制。

4.1.4 結合ACE2 Sessu等[45]研究發現，運用分子對接技術預測了甘草酸在SARS-CoV-2刺突蛋白受體結構域處有效結合，且在ACE2結合界面表現相似的結合親和力，結果表明甘草酸可用于制定抗SARS-CoV-2的輔助療法。中山大學第三附屬醫院團隊[46]發現甘草酸苷具有能與 ACE2 的分子結合從而抑制SARS-CoV 和SARS-CoV-2入侵細胞的潛能，因其可減輕CS、預防ARDS和多臟器損傷而減少炎癥性疾病重癥化，而且還具有抗病毒潛能，建議將甘草甜素嘗試用于新型冠狀病毒感染的治療。

4.2 甘草酸及其制劑靶向宿主抗新冠感染作用機制

4.2.1 抗炎與免疫調節作用 甘草酸可明顯抑制脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導的ARDS中IL-1β、MCP-1、COX2、HMGB1等炎癥因子的產生，并通過上調ACE2和抑制caveolin-1/NF-κB 信號通路減輕ARDS[47]。甘草酸能夠顯著減輕肺損傷，并減少了LPS誘導的炎癥因子TNF-α、IL-1β和HMGB1的產生。甘草酸誘導的自噬表現為通過上調LC3-II/I和Beclin-1的蛋白水平并下調SQSTM1/P62來增加自噬體的數量。通過調節PI3K/AKT/mTOR通路相關的自噬抑制ARDS炎癥因子的產生[48]。HMGB1是炎癥過程中重要的細胞外介質，并且能夠調節 ACE2 受體的表達，對SARS-CoV-2 進 入 宿 主 細 胞 有 重 要 作 用 ，并 且HMGB1 是炎癥的報警分子[49]。甘草酸作為 HMGB1的天然抑制劑，能夠直接與HMGB1結合抑制其細胞因子活性[50]。在氣管內LPS給藥之前用甘草酸單銨預處理顯著降低肺組織濕干重比、支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中的總白細胞數和中性粒細胞百分比，并以劑量依賴性方式降低肺組織中的髓過氧化物酶活性。用甘草酸單銨預處理也顯著提高了超氧化物歧化活性并誘導了BALF中的丙二醛含量，抑制了肺組織中的環磷酸腺苷磷酸二酯酶活性的增加。此外，它可以上調ARDS肺組織中白細胞介素IL-10的水平，下調TNF-α的水平。這些結果表明，甘草酸單銨對LPS誘導的ARDS的抗炎作用是由于其抑制cAMP-PDE活性、氧化應激及其對細胞因子作用的調節的能力。因此，使用甘草酸單銨有利于治療ARDS[51]。LPS在細胞中誘導TLR2上調，TLR2過表達激活TLR信號通路促進ARDS。甘草酸處理后，TLR2的表達降低。此外，還發現ARDS小鼠的炎癥細胞數量、膠原沉積、MIP-2、KC、IL-4、IL-6、GM-CSF 和IFN-γ表達增加，而甘草甜素可改善這種情況[52]。

4.2.2 保肝與保護細胞膜作用 甘草酸苷通過阻斷花生四烯酸在起始階段的代謝水平，保護肝細胞膜，具有保肝降酶作用[53]。通過對復方甘草酸苷臨床治療SARS分析的結果表明，甘草酸苷因具有糖皮質激素的功能，其可產生保護細胞膜的作用，具有保肝降酶的作用[54-55]。Kroes等人實驗表明甘草酸苷可以促進肝細胞再生，是肝細胞的保護劑[56]。

4.3 甘草酸類制劑在抗新冠感染中的臨床應用2020年初武漢新冠感染疫情初期，武漢大學藥學院專家采用已上市甘草酸制劑對居家隔離治療的患者進行嘗試性救助。復方甘草酸苷片(每片含甘草酸單銨鹽(以甘草酸苷計)25 mg、甘氨酸25 mg、DL-甲硫氨酸25 mg)曾在新疆新冠定點診療醫院用于新冠感染的臨床治療，特別是對并發肝損傷患者的治療發揮了協同抗病毒作用，替代或減少激素使用(緩解炎癥風暴)的作用。根據中國臨床試驗注冊中心官網公開信息，甘草酸二銨腸溶膠囊聯用維生素C片在治療新型冠狀病毒肺炎的有效性和安全性的臨床研究，已完成臨床試驗注冊備案登記[57]。

在近三年抗擊新冠感染的過程中，將甘草制劑運用于臨床治療已被多篇文獻報道。周外民等將甘草酸二銨用于治療新冠感染，實驗結果表明甘草酸可降低肝損傷不良反應[58]。李璐等[59]將新冠感染合并肝功能異常患者分為觀察組與對照組。觀察組患者出現肝功能異常后使用甘草酸二銨治療，對照組患者使用其他保肝藥治療，所有患者均按照《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第五版)》進行治療，發現甘草酸二銨治療新冠感染合并肝功能異常患者可有效抑制患者的炎癥反應并保肝。何蓉會等[60]使用甘草酸二銨聯合抗病毒治療了重癥新冠感染患者。廣西地區新冠感染定點醫院采用阿比多爾聯合甘草酸二銨腸溶膠囊治療新冠感染[61]。Elsersy等通過對照臨床研究發現聚維碘酮和甘草酸鼻腔口腔聯合噴霧劑可加速新冠感染患者在疾病早期的實驗室和臨床恢復，并減少病毒的家庭傳播[62]。Gomma等將甘草酸聯合乳香酸治療新冠感染輕中度患者取得顯著療效[63]。武漢市第三醫院對349例新冠感染患者給予甘草酸二銨或者異甘草酸鎂輔助治療，發現其能抑制炎癥反應，預防肺纖維化，延遲器官損傷[64]。王濤等[65]在常規治療的基礎上加用異甘草酸鎂注射液與甘草酸二銨腸溶膠囊，發現聯合甘草酸制劑可縮短新冠感染患者臨床癥狀持續時間。孫信林等[66]對新冠感染患者給予甘草酸二銨腸溶膠囊預防性保肝治療，發現甘草酸二銨對新冠感染患者的肝功能具有保護作用。劉積慶等[67]給予危重型新冠感染致肝損傷患者異甘草酸鎂注射液，發現異甘草酸鎂注射液在危重型新冠感染致肝損傷患者中療效明顯。Liu等[68]給予189名新冠感染合并肝損傷的患者甘草酸二銨與異甘草酸鎂，發現其在改善肝功能、抑制炎癥、增強免疫方面具有顯著療效。

5 討論

綜上所述，甘草酸類制劑通過靶向病毒與宿主，發揮多重機制，治療早期新冠感染。已上市的甘草酸藥物制劑在國內外抗擊新冠疫情中已獲得寶貴的臨床“人用經驗”，有必要開展復方甘草酸苷片等甘草酸類制劑治療新冠感染的系統規范的臨床研究，為規范臨床應用方案提供依據。