Circ_0013745靶向調控miR-126-5p對慢性髓系白血病細胞K562的遷移、侵襲和增殖的影響

焦衛云， 劉媛媛， 鮑揚漪

(合肥市第一人民醫院血液內科， 合肥 230000)

慢性粒細胞白血病(Chronic myeloid leukemia, CML)是一種由9q34和22q11易位引起的費城(Ph)染色體為特征的骨髓增生性疾病。實驗證實位于9q34的c-ABL基因易與位于22號染色體和位于22q11的BCR基因形成BCR-ABL融合基因[1]。BCR-ABL是一種構成性活性酪氨酸激酶，能夠將造血干細胞轉化為白血病干細胞(LSCs)[2]。現階段CML的標準分子靶向治療是酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，它能根除大部分疾病，但不能根除靜止的白血病干細胞[3]。有研究表明，低存活率和化療耐藥仍是CML治療過程中存在的主要問題[4]。環狀RNA(circRNA)是近年來發現的一類非編碼RNA，具有包括調節細胞增殖、侵襲、凋亡等多種生物學功能[5]。Liu等[6]微陣列分析篩選出CML患者治療前的腫瘤干細胞和相應的正常間充質干細胞中差異表達的circRNA發現，基因circ_0013745在腫瘤干細胞中顯著上調，故探尋CML的診斷生物標記物及其調控機制對提高CML的診斷和治療水平至關重要。本研究探討基因circ_0013745靶向調控miR-126-5p對CML細胞K562遷移、侵襲和增殖的影響，為CML治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標本 收集2019年7月—2021年1月在合肥市第一人民醫院診斷治療的慢性髓系白血病患者與健康捐贈者外周血樣本30對，并置于-80℃超低溫冰箱保存。本研究已通過合肥市第一人民醫院倫理委員會審核批準，患者及家屬均知情同意。

1.1.2 試劑與儀器 293T細胞、慢性髓系白血病細胞株K562購自中國科學院細胞庫(上海)。RNA提取試劑Trizol試劑、miRNA、 cDNA第一鏈合成試劑盒、cDNA合成試劑盒、定量聚合酶鏈反應(PCR)試劑、Lipofectamine 3000均購自美國Invitrogen公司。DMEM培養基、胎牛血清由美國Gbico公司提供。小干擾RNA (siRNA)對抗circ_0013745 (si-circ_0013745)及其陰性對照(si-NC)，miR-126-5p mimic或inhibitor及其相應的對照(mimic NC或inhibitor NC)購自廣州銳博生物科技有限公司。細胞計數試劑盒8(Cell counting kit-8,CCK-8)購自上海碧云天(Beyotime)公司。Transwell小室購自美國Corning公司。熒光素酶報告基因試劑盒購自美國Promrga公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與轉染 用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養基培養K562、293T細胞。所有細胞保存于37C°、5%CO2的加濕培養箱中。前一天在6孔板加入消化后的細胞懸液，每孔約6×105個細胞，待細胞貼壁后，用Lipofectamine 3000將siRNA、模擬物、inhibitor和載體轉染至K562細胞中，并分為si-NC組、si-circ_0013745組、si-circ_0013745+miR-126-5p inhibitor組；標本組分為健康人組、CML組。

1.2.2 實時熒光定量PCR實驗(Real time quantitative PCR，RT-qPCR) 按照說明書，利用Trizol試劑盒從各組細胞中分離出總RNA，All-in-One miRNA RT-qPCR檢測試劑盒檢測miR-126-5p的表達量。采用Prime Script RT試劑盒逆轉錄總RNA為cDNA。用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒進行RT-qPCR。引物采用Primer 5設計。熱循環條件：95℃ 5 min、95℃ 30 s、65℃ 45 s。實驗重復3次，分別以U6和GAPDH作為miR-126-5p和circ_0013745的內部對照。利用2-ΔΔCq方法對相關基因進行分析和歸一化。引物設計見表1。

表1 引物序列設計

1.2.3 平板克隆實驗 將轉染后的K562細胞接種于6孔板(800細胞/孔)中，在含10%胎牛血清的完全培養基中培養2周。用4%多聚甲醛固定細胞，0.1%結晶紫染色30 min，PBS洗滌1次。對直徑大于1 mm的集落進行計數。

1.2.4 細胞增殖實驗 根據說明書要求使用CCK-8試劑盒。轉染后的K562細胞置于96孔板(2 000細胞/孔)中培養0、24、48和72 h。在指定時間點，每孔加入CCK-8溶液(10 μL)，用酶標儀在450 nm處檢測光密度(OD)值。

1.2.5 細胞遷移和侵襲實驗 Transwell遷移實驗中，將轉染后無血清培養基懸浮的K562細胞加入至Transwell上室，同時將血清培養液灌滿下室。24 h后，用多聚甲醛固定細胞，結晶紫染色。隨機選取3個視野，在顯微鏡下(×100)拍照，計數遷移細胞的數量。Transwell侵襲實驗中，將Matrigel加入Transwell小室上室，37℃過夜，使Matrigel聚合成凝膠。其余步驟同遷移實驗。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因檢測 使用Starbase數據庫(http://starbase.sysu.edu.cn) 預測circ_0013745的潛在靶點。根據說明書，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統進行檢測。將circ_0013745的野生型(wt)和突變型(mut)序列分別克隆至pmirGLO載體上。將293T細胞接種于12孔板。構建的載體與miR-126-5p mimic或mimic NC共轉染293T細胞，并分為mimic NC與circ_0013745-WT/circ_0013745-MUT共轉染組、miR-126-5p mimic與circ_0013745-WT/circ_0013745-MUT共轉染組，48 h后用雙熒光素酶報告基因分析系統(Promega)定量熒光素酶活性。所有實驗重復3次。

2 結果

2.1 circ_0013745在慢性髓系白血病中的表達情況circ_0013745位于1號染色體上，由MAN1A2基因的3個外顯子組成，呈環狀結構(圖1A)。RT-qPCR檢測結果發現，CML患者的外周血中circ_0013745的表達量(8.91±3.88)顯著高于健康人的表達量(2.68±2.39)，差異有統計學意義(t=7.369，P<0.001)(圖1B)。

2.2 K562細胞平板克隆能力及增殖能力比較平板克隆實驗結果顯示，si-circ_0013745組的K562細胞克隆個數(264.33±7.57)較si-NC組的細胞克隆個數(384.67±14.57)顯著降低，差異有統計學意義(P<0.001)(圖2A)。CCK-8增殖實驗結果顯示，si-circ_0013745組細胞增殖能力(1.12±0.02)較si-NC組細胞增殖能力(1.43±0.06)顯著降低，差異有統計學意義(t=8.413，P<0.01)(圖2B)。

2.3 K562細胞遷移和侵襲實驗結果比較Transwell遷移實驗結果顯示，si-NC組、si-circ_0013745組遷移的K562細胞個數分別為(197.33±26.40)、(74.67±7.51)。si-circ_0013745組細胞遷移能力低于si-NC組遷移能力，差異有統計學意義(t=7.739，P<0.01)(圖3A)。Transwell侵襲實驗結果顯示，si-circ_0013745組的侵襲細胞個數較si-NC組顯著降低(t=4.679，P<0.01)(圖3B)。

注：A，circ_0013745的環狀結構圖；B，circ_0013745的表達量；與健康人比較，***P<0.001。

注：A，不同組平板克隆試驗；B，不同組CCK-8增殖實驗；與si-circ_0013745組比較，**P<0.01； 與si-NC組比較， ***P<0.001。

注：A，不同組K562細胞遷移能力；B，不同組K562細胞侵襲能力；與si-NC 組比較， **P<0.01。

2.4 雙熒光素酶報告基因檢測結果比較Starbase數據庫分析結果顯示，miR-126與circ_0013745 3’UTR結合，結合序列見4A。雙熒光素酶報告基因檢測結果表明，與NC組(1.06±0.07)比較，miR-126-5p mimic與circ_0013745-WT共轉染組(0.48±0.06)的熒光素酶活性顯著降低(t=11.130，P<0.001)，而miR-126-5p mimic與circ_0013745-Mut共轉染組的熒光素酶活性無明顯變化(t=0.316，P>0.05)(圖4B)。證明circ_0013745與miR-126-5p結合。

2.5 K562細胞挽救實驗結果比較敲除circ_0013745后，miR-126-5p的表達量顯著上升(P<0.001)(圖5A)。進一步挽救實驗發現，與si-circ_0013745組細胞增殖率(1.06±0.03)比較，si-circ_0013745+miR-126-5p inhibitor組細胞增殖率(1.27±0.03)顯著增高，差異有統計學意義(t=7.175，P<0.01)(圖5B)。

注：A，結合序列；B，雙熒光素酶報告基因實驗結果；與miR-126-5p mimic比較， ***P<0.001。

注：A，敲除circ_0013745后miR-126-5p表達量；B，各組CCK-8增殖實驗。與si-circ_0013745組比較，si-circ_0013745組與si-circ_0013745+miR-126-5p inhibitor組比較， **P<0.01； 與si-NC組比較，***P<0.001。

3 討論

CML是一種獲得性骨髓增生性惡性腫瘤，分布于多個年齡段，且發病率隨年齡增加而增加[7]。盡管酪氨酸激酶抑制劑可改善大多數患者的預后并延長其生存期，但CML的患病率仍在上升[8]。白血病的發展包含多種生物學過程，目前針對白血病的發病機制研究尚不清楚，本研究通過評估circ_0013745在CML中的表達及機制，為探索CML的發病機制提供理論基礎。

circRNA已被證實是胃癌[9]、肝癌[10]等癌癥惡性進展的生物標志物。現階段已有多項研究表明，circRNA參與CML的發生發展，強調circRNA作為CML潛在生物標志物的重要性[11]。Ping等[12]用circRNA微陣列評估CML中的circRNA譜發現，CML患者細胞和血清中的hsa_circ_100053水平均升高。此外，本研究探索發現一種位于1號染色體上的circRNAcirc_0013745在CML發展中的作用。經RT-qPCR發現，circ_0013745在CML患者外周血中高表達，提示circ_0013745可能是區分CML患者與健康個體的生物標志物。本研究還發現，敲除circ_0013745可抑制CML細胞K562的平板克隆能力、增殖能力、遷移和侵襲能力，證實circ_0013745對CML的進展發揮著促癌作用，進一步證實circRNA對CML進展發揮癌基因作用。Xia等[13]發現，沉默circ-CBFB可顯著抑制慢性白血病細胞的增殖能力，阻滯細胞周期進展，并通過結合miR-607誘導細胞凋亡，導致β-catenin通路失活，從而影響白血病的進展。這與本研究結果類似。此外，有學者發現，高circHIPK3與CML患者預后差相關，抑制circHIPK3可抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡[14]，以上研究均證實circRNA參與CML的發生發展。

circRNA作為miRNA海綿被許多研究結果證實[15-16]。在本研究中，通過生物信息學分析發現，circ_0013745與miR-126-5p相互作用并靶向結合，沉默circ_0013745可抑制CML細胞的增殖，但該作用可通過沉默miR-126-5p發生逆轉，表明circ_0013745通過靶向調控miR-126-5p促進CML細胞的增殖、侵襲。其它研究發現，miR-126-5p在許多癌癥中低表達，并作為腫瘤抑制因子調節癌癥進展[17-18]。急性髓系白血病中靶向調控miR-126可抑制白血病的發展和白血病干細胞的維持[19]。另外，miR-126在CML患者血液中的表達量下調[20]，可靶向調控細胞周期、MAPK、生長抑制、TGF β、p53信號通路的相關基因[21]。本研究后續將深入分析臨床病理學特征和完善挽救實驗等細胞功能實驗、動物實驗方法，進一步證實circ_0013745影響CML的作用機制。

綜上所述，circ_0013745在CML患者外周血中高表達，且通過靶向調控miR-126-5p促進CML細胞的增殖、遷移和侵襲。這一發現為探究CML的發生機制提供理論基礎。