EZRIN與ASAP3在食管鱗癌中的表達及臨床病理學意義

管雅玲， 季 敏， 肖錦玲， 劉 麗， 蘇麗萍， 馬麗娟， 蒲紅偉

(新疆醫科大學1基礎醫學院， 2第一附屬醫院病理科， 3第一附屬醫院學科建設科， 烏魯木齊 830011)

食管癌是人類最常見的消化道惡性腫瘤之一，它是癌癥相關死亡的第六大常見原因，也是全球第七大最常見的癌癥[1]。食管癌在組織學上可分為食管腺癌和食管鱗癌，其中食管鱗癌約占我國食道腫瘤病例的90%以上[2]。食管鱗癌患者通常由于診斷時期較晚而預后較差[3]，因此早期精準診斷對提高食管鱗癌患者整體生存率具有重要意義[4]。

EZRIN是ERM蛋白家族的重要成員，對蛋白結構穩定性和完整性的維持發揮著重要作用[5]。研究表明，EZRIN在不同癌癥的侵襲和轉移中充當腫瘤轉移調節劑[6]。此外，它還介導許多細胞活動，如極性、運動性、黏附和生長等，這些與癌癥的發展和進展有關。ASAP3是一種 Arf GTPase 激活蛋白，也稱為 DDEFL1和ACAP4，具有SH3結構域、錨蛋白重復序列和PH結構域3，在運輸細胞內囊泡、組裝細胞骨架、促進細胞生長和遷移等方面發揮重要作用[7]。Fang等[8]證明EZRIN可通過ASAP3的N端400個氨基酸以蛋白激酶A介導的磷酸化依賴性方式與ASAP3相互作用。有學者闡明Hp相關慢性胃炎癌變的分子機制，與EZRIN-ASAP3信號通路中細胞可塑性的調控及其非可控性炎癥介導的腫瘤遷移有關，同時還篩選出ASAP3的小分子抑制劑BUCM1并證實了其治療作用，進一步驗證EZRIN-ASAP3信號通路在腫瘤的發生、發展中具有重要作用[9]。已有學者證實EZRIN在食管鱗癌中高表達[10]，但目前對于EZRIN與ASAP3在食管鱗癌中表達狀態如何，是否具有臨床意義方面的研究尚少。本研究旨在分析食管鱗癌中EZRIN、ASAP3的表達水平及其與臨床病理參數間的關系，以及與預后的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料食管鱗癌組織芯片樣本175例及食管鱗癌癌旁組織芯片樣本60例由新疆醫科大學第一附屬醫院樣本庫提供，收集2008年1月—2018年12月經手術切除的食管鱗癌組織，其中男性123例，女性52例。納入標準：首次病理診斷為食管鱗癌，既往未接收過放療、化療等任何治療，且具有完整的臨床病理資料者。排除標準：存在中樞神經系統惡性淋巴瘤或其他影響生存期的惡性疾病患者；精神類疾病患者；臨床資料不完整或術前經過治療者，制片不佳無法判斷免疫組織化學結果的。該項目獲得新疆醫科大學醫學倫理委員會批準，倫理審批號：K201909-03，所有患者均已簽署標本使用知情同意書。

1.2 主要試劑小鼠單克隆EZRIN抗體(購于英國Abcam公司，貨號：ab4069)；兔多克隆ASAP3抗體(購于中國Bioss公司，貨號：bs-5832R)；PBS、EDTA抗原修復液、山羊血清、過氧化氫、通用型二抗(均購于中國中杉金橋)。

1.3 免疫組織化學方法將芯片組織進行脫蠟、水化，H2O2阻斷內源性過氧化物酶，使用EDTA溶液進行抗原修復，加入小鼠單克隆EZRIN抗體(1∶500)、兔多克隆ASAP3抗體(1∶150)，陰性對照用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，陽性對照用食管鱗癌陽性組織芯片，37℃孵育時間60 min；加通用型二抗，PBS洗凈，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，封片。結果的分析及判定：由兩名主治及以上高級病理學醫師使用雙盲法對切片進行評估，根據其染色強度，將切片分為未染色(無色)、弱染色(淺黃色)、中度染色(淺棕色)和強染色(深棕色)，分別得分為0、1、2和3。陽性細胞的標準如下：0(0%)、1(1%～30%)、2(31%～60%)和3(61%～90%)。根據染色指數(SI =染色強度×陽性細胞的百分比)，染色結果記錄為陰性(0～3分)或陽性(4～9分)，其中4～5分被認為低水平表達，6～7分中等表達，8～9分高水平表達[11]。根據上述標準，EZRIN與ASAP3表達分為強陽性、中度陽性、弱陽性和陰性。

1.4 生存分析主要通過電話、門診檢查和住院隨訪等三種方式來實時動態收集患者近期臨床和生存健康質量信息，以患者的死亡發生時間為終點事件，隨訪記錄信息至2019年12月31日。失訪患者自失去聯系當月起按截尾數據計算。

1.5 統計學分析所有樣本數據均采用SPSS 26.0軟件進行統計分析，計數資料采用χ2檢驗和Fisher精確概率法檢驗，分析EZRIN與ASAP3的表達與臨床病理參數的相關性；采用Spearman相關分析法進行關聯性分析；繪制Kaplan-Meier曲線以評估EZRIN與ASAP3在食管鱗癌患者中的預后值；采用Cox回歸試驗分析影響食管鱗癌預后的潛在因素，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 食管鱗癌患者EZRIN表達與臨床病理特征的關系免疫組化結果顯示，EZRIN在癌旁組織呈陰性表達，EZRIN在食管鱗癌的細胞質中呈高表達，見圖1a-d；HE染色結果見圖1e-f。EZRIN在食管鱗癌組織和癌旁組織中的陽性表達率分別為82.3%和20.0%，差異具有統計學意義(χ2=77.675，P=0.000)。EZRIN與分化程度、浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移具有相關性；與性別、年齡、腫瘤大小、血管浸潤、神經侵犯無相關性，見表1。

表1 EZRIN在食管鱗癌中的表達及臨床相關病理參數分析

2.2 食管鱗癌患者ASAP3表達與臨床病理特征的關系ASAP3在癌旁組織中呈陰性表達，在胞漿中呈高表達，見圖2a-d；HE染色結果見圖2e-f。ASAP3在食管鱗癌組織和癌旁組織中的陽性表達率分別為70.9%和30.0%，差異有統計學意義(χ2=31.190，P=0.000)。ASAP3與性別、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、TNM分期及淋巴結轉移具有相關性；與年齡、血管浸潤、神經侵犯無相關性，見表2。

a：免疫組化圖，EZRIN在癌旁組織呈陰性表達；b-d：免疫組化圖，EZRIN在食管鱗癌的細胞質中呈高表達；e：HE染色圖，EZRIN癌旁組織；f：HE染色圖，EZRIN食管鱗癌組織。

a：免疫組化圖，ASAP3在癌旁組織呈陰性表達；b-d:免疫組化圖，ASAP3在食管鱗癌的細胞質中呈高表達；e：HE染色圖，ASAP3癌旁組織；f：HE染色圖，ASAP3食管鱗癌組織。

表2 ASAP3在食管鱗癌中的表達及臨床相關病理參數分析

2.3 EZRIN與ASAP3在食管鱗癌發展中的相關性分析EZRIN和ASAP3共同陽性表達108例(75.0%)，EZRIN陽性表達ASAP3陰性表達36例(25.0%)，EZRIN和ASAP3共同陰性表達15例(48.4%)，EZRIN陰性表達ASAP3陽性表達16例(51.6%)。EZRIN與ASAP3表達呈正相關(r=0.196，P=0.009)。

2.4 EZRIN與ASAP3在食管鱗癌中的表達水平與預后的相互關系生存期類型分為5年生存、總生存、無進展生存、無病生存，本文應用總生存期(OS)對食管鱗癌患者預后進行分析，結果顯示，EZRIN高表達患者中位總生存時間(OS)為40個月，低表達患者OS為38個月，兩者間未發現顯著相關性(P=0.919)，見圖3a；與ASAP3低表達患者相比，ASAP3高表達患者的總生存時間更短(P<0.05)，見圖3b；同時，當腫瘤直徑>3 cm時，ASAP3高表達患者的OS時間比低表達患者短，存在顯著相關性(P=0.000)，見圖3c；在病理分期TNM III期，ASAP3高表達患者的OS時間比ASAP3低表達患者短(P=0.000)，見圖3d；當腫瘤浸潤全層以及患者發生淋巴結轉移且ASAP3高表達時，OS值較短(P= 0.004，P= 0.000)，見圖3e、f。表明ASAP3的表達水平與食管鱗癌患者的預后密切相關。

2.5 影響食管鱗癌患者預后的因素Cox單因素分析結果顯示，性別、TNM分期、淋巴結轉移、血管浸潤、ASAP3表達情況對食管鱗癌患者預后有影響(P<0.05)，見表3。以食管鱗癌患者的生存時間和生存狀態為因變量，將單因素分析中有統計學意義的5個病理參數(性別、TNM分期、淋巴結轉移、血管浸潤、ASAP3表達情況)作為協變量，納入多因素Cox比例風險回歸模型。TNM分期設為啞變量，變量賦值見表4，結果顯示TNM IIIA+B+C、ASAP3高表達是影響食管鱗癌預后不良的獨立危險因素(HR=2.090，P<0.01；HR=0.149，P<0.01)，見表5。

表3 食管鱗癌患者生存預后的Cox單因素分析/例

圖3 EZRIN、ASAP3在食管鱗癌中表達水平的Kaplan-Meier生存曲線

表4 變量賦值表

表5 食管鱗癌患者生存預后的Cox多因素分析

3 討論

食管鱗癌是具有高侵襲性的惡性腫瘤之一，且發病率呈逐年升高趨勢。目前，食管鱗癌的治療方式主要包括手術，化療和放療。然而，多數食管癌患者確診時已處于中晚期，盡管手術及放、化療在一定程度上延長了患者的生存時間，但術后5年生存率仍不足30%。因此，需要進一步研究食管鱗癌的發病機制，以優化診斷和治療方案。

EZRIN蛋白由位于染色體6q 25.2-q26的EZR基因編碼，含有FERM結構域(band 4.1 protein, Ezrin, Radixin, Moesin)，中央螺旋連接區域和ERM 相關結構域，是ERM蛋白家族中研究最多的成員，可以促進細胞生長、細胞極性、運動性、黏附功能，對維持細胞蛋白結構和功能具有重要作用，亦是促進癌癥發生和進展的基因[12]。在腫瘤發展過程中，EZRIN蛋白的相對膜定位增加，細胞之間接觸被破壞。因此，EZRIN蛋白的活化促進了腫瘤進展和侵襲的過程。Chetry等[13]研究發現EZRIN在宮頸癌中上調且與晚期轉移和不良預后有關。Kolegova等[14]學者研究發現EZRIN主要分布在肺癌組織和轉移灶中,EZRIN表達與肺癌患者的淋巴轉移程度，惡性表型和晚期TNM分期顯著相關，下調EZRIN蛋白可以逆轉肺癌的惡性生物學行為。有研究發現EZRIN通過Akt信號轉導促進乳腺癌進展和轉移，并且增加乳腺癌患者復發的風險[15]。目前已有研究表明EZRIN在多種腫瘤中發揮作用，其中在食管鱗癌細胞發揮促癌作用，Li等[16]團隊研究分析了98名健康人群和149名食管鱗癌患者的血清中EZRIN的抗體表達水平，研究結果顯示，血清樣本中EZRIN的自身抗體水平在食管鱗癌患者中呈高表達，但其患者血清中EZRIN抗體陽性表達率與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤浸潤深度、腫瘤部位、組織學分級、淋巴結狀態無顯著差異。本次實驗結果顯示EZRIN 陽性表達率為82.3%(144/175)，說明 EZRIN的表達可能與食管鱗癌的發生、發展有關。同時本研究結果顯示，EZRIN與分化程度、浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移有關,其中低分化、全層浸潤、TNM IIIA+B+C期及有淋巴結轉移陽性率更高，提示EZRIN的表達在食管鱗癌分化程度、浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移方面存在差異，這與Li等[16]團隊的研究結論不一致，考慮可能與樣本量取材部位差異以及樣本個體差異、樣本量等混雜因素導致的數據及結果偏倚所致。

ASAP3是PCAF的同源底物，在Lys311中被乙酰化，這種CCL18(CC趨化因子配體18)引發的乙酰化通過調節ARF6活性在膜-細胞骨架動力學和細胞遷移中起關鍵作用[17]。Ha等[18]研究發現ASAP3被鑒定為Arf GAP，可以調節與癌細胞侵襲正常組織相關的細胞遷移。ASAP3可促進腫瘤的轉移，且ASAP3表達高的患者預后較差。Mao等[19]通過免疫組織化學研究了ASAP3在乳腺癌中的表達，并與正常乳腺組織配對，發現ASAP3表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期顯著相關，與絕經期或年齡無關。田海英[20]研究發現ASAP3蛋白在某些大腸癌組織結構中的極高選擇性表達促進導致了消化道腫瘤干細胞的迅速增殖、侵襲擴散和轉移，從而間接影響大腸癌晚期患者未來的預后。本研究結果發現ASAP3在食管鱗癌組織的陽性表達率顯著高于癌旁組織，并且與患者的臨床病理參數及預后相關，差異具有統計學意義(P<0.05)。ASAP3可與EZRIN相互作用，孟涵等[21]研究發現EZRIN蛋白表達水平在慢性胃炎脾胃虛寒證、脾胃濕熱證患者的病理進展中無顯著差異，ASAP3蛋白在異型增生階段表達水平較高，ASAP3-EZRIN信號通路在慢性胃炎惡性轉化過程中發揮著一定作用。同時本研究結果顯示EZRIN與ASAP3表達呈正相關(r=0.196，P=0.009)，EZRIN與生存期之間的差異無統計學意義(P>0.05)，考慮可能與樣本量偏少以及樣本個體差異導致的數據及結果偏倚所致。與ASAP3低表達患者相比，ASAP3高表達患者的總生存時間更短(P<0.05)，ASAP3高表達和TNM IIIA+B+C是影響食管鱗癌預后不良的獨立危險因素。因此推斷EZRIN和ASAP3可能在食管鱗癌中共同作用，促進食管鱗癌的發生發展過程，并且可能通過EZRIN-ASAP3信號通路調控食管鱗癌的發生發展。

綜上所述，本研究證實了EZRIN和ASAP3在食管鱗癌中顯著高表達，并且呈正相關。但本次研究局限于免疫組化實驗結果，不能充分準確地全面解釋EZRIN和ASAP3在食管鱗癌發生發展中的具體作用機制，這也是本課題后續研究的主要內容，為食管鱗癌臨床治療和診斷工作提供新的靶點和思路。