基于非靶向代謝組學與轉錄組學探究氨基酸緩解甘草酸苷致大鼠假性醛固酮增多癥的分子機制

王子航， 單 宇， 謝湘云,2， 王 梅,2,3， 高曉黎,2,3

(1新疆醫(yī)科大學藥學院； 2新疆及中亞特色醫(yī)藥資源教育部工程研究中心； 3新疆天然藥物活性組分與釋藥技術重點實驗室， 烏魯木齊 830017)

甘草酸類制劑是治療慢性肝病，改善肝功能異常的一線推薦藥物；還可以治療濕疹、皮膚炎、斑禿。該藥物臨床主要不良反應為假性醛固酮增多癥(Pseudo-hyperaldosteronism, PA)，常表現(xiàn)為水鈉潴留導致的水腫。復方甘草酸苷片是由甘草酸單銨鹽(Monoammonium glycyrrhizinate，MAG)、甘氨酸(Glycine，Gly.)、DL-甲硫氨酸(DL-Methionine，Met.)組成的復方制劑，其中甘草酸單銨鹽具有保護肝細胞膜[1]、抗炎[2]、抗病毒[3]、免疫調節(jié)[4]及類固醇激素樣[5]作用，配方中甘氨酸和DL-甲硫氨酸可緩解甘草酸苷的副作用PA，提高肝臟的解毒能力[6]，減少過敏反應。但目前尚未見研究報道甘氨酸與DL-甲硫氨酸緩解由甘草酸苷引起的輕微PA癥的機制[7]。本研究采用代謝組學多參數(shù)應答的特性，通過差異代謝物的鑒定與分析來研究氨基酸對PA緩解的代謝變化，通過轉錄組學數(shù)據(jù)分析與醛固酮增多癥相關的醛固酮腺瘤患者(Aldosterone Producing Adenoma，APA)差異基因功能，篩選甘氨酸和DL-甲硫氨酸改善醛固酮增多的可能靶點。以期通過實驗驗證復方甘草酸苷片中兩種氨基酸甘氨酸和DL-甲硫氨酸的增效減毒作用機制。

1 材料與方法

1.1 試藥甘草酸單銨鹽(陜西富捷藥業(yè)有限公司，2019110302)；甘氨酸(天津天藥藥業(yè)股份有限公司，AGLYB190442)；DL-甲硫氨酸(修正藥業(yè)集團柳河制藥有限公司，20190919)；蘇木素-伊紅染料(北京中杉金橋生物技術有限公司，BSBA-4025)；乙腈(美國Merc公司，1499230-935)；甲醇(美國Thermo Fisher公司，A456-4)；氨水(美國Thermo Fisher公司，A470-500)；乙酸銨(美國Sigma公司，70221)。

1.2 實驗動物取18只SPF級SD大鼠，雌雄各半，由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供，實驗動物許可證號為SYXK(新)2018-0003；飼養(yǎng)條件：溫度20～25℃，相對濕度40%～70%，光照12 h/d，自由進食與飲水。

1.3 儀器AB triple TOF 6600型石蠟切片機(上海徠卡儀器有限公司)；AB SCIEX型病理組織包埋機(上海徠卡儀器有限公司)；Agilent 1290 Infinity 型LC超高壓液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 動物分組及給藥劑量 將18只SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周，隨機分成3組：空白對照組，甘草酸苷組，甘草酸苷與氨基酸復方組。灌胃周期14 d，空白對照組，灌胃相同體積的生理鹽水；甘草酸苷組，以甘草酸單銨鹽計，灌胃300 mg/kg甘草酸單銨鹽溶液；甘草酸苷與氨基酸復方組，灌胃300 mg/kg甘草酸單銨鹽與氨基酸的混合溶液，組成為甘草酸單銨鹽∶甘氨酸∶DL-甲硫氨酸(1.25∶1∶1，w:w:w)。

1.4.2 樣本采集及處理 各組大鼠灌胃14 d后，禁食12 h，麻醉，暴露腹腔，收集肝臟左、中葉及腎臟。腎臟及肝臟中葉保存于10%多聚甲醛中用于后續(xù)HE染色，肝臟左葉保存于-80℃冰箱用于代謝組學分析。肝臟組織于4 ℃緩慢解凍后，取適量樣本加入預冷甲醇-乙腈-水混合溶液(2∶2∶1，v/v)，渦旋混合，低溫超聲30 min，-20℃靜置10 min，14 000 r/min，4℃離心20 min，上清液真空干燥，加入100 μL乙腈水溶液(乙腈∶水=1∶1，v/v)復溶，渦旋，14 000 r/min,4℃離心15 min。收集上清用于超高效液相色譜分析-串聯(lián)質譜(UHPLC-MS)分析。通過匯集研究過程中收集的肝臟組織樣品的等分試樣制備QC樣品。

1.4.3 大鼠腎臟、肝臟組織學檢查 采集的腎臟、肝臟組織通過脫水、包埋、切片、蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察肝臟及腎臟的組織學損傷程度。

1.4.4 色譜條件 色譜柱：Agilent 1290 Infinity LC 超高效液相色譜系統(tǒng)(UHPLC)HILIC色譜柱；柱溫25℃；流速0.5 mL/min；進樣量2 μL；流動相組成：25 mmol 乙酸銨與25 mmol氨水混合水溶液與乙腈；梯度洗脫程序見表1。質譜條件：采用電噴霧電離正離子和負離子模式，ESI 源設置參數(shù)如下：霧化氣輔助加熱氣1∶60，輔助加熱氣2∶60，氣簾氣(CUR)30 psi，離子源溫度600℃，噴霧電壓(ISVF)±5 500 V(正負兩種模式)；一級質荷比檢測范圍：60～1 000 Da，二級子離子質荷比檢測范圍：25～1 000 Da，一級質譜掃描累積時間：0.20 s/spectra, 二級質譜掃描累積時間0.05 s/spectra；二級質譜采用數(shù)據(jù)依賴型采集模式獲得，并且采用峰強度值篩選模式，去簇電壓：±60 V(正負兩種模式)，碰撞能量：35±15 eV，IDA設置：動態(tài)排除同位素離子范圍：4 Da，每次掃描采集10個碎片圖譜。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.4.5 代謝組學數(shù)據(jù)分析方法 將Wiff格式原始數(shù)據(jù)經ProteoWizard轉換成mzXML格式，采用XCMS軟件進行峰對齊、保留時間校正和提取峰面積。對XCMS提取的數(shù)據(jù)進行代謝物結構鑒定、數(shù)據(jù)預處理、實驗數(shù)據(jù)質量評價，再進行單變量統(tǒng)計分析、差異代謝物篩選、KEGG通路分析。

1.4.6 轉錄組學數(shù)據(jù)分析及甘氨酸、DL-甲硫氨酸作用機制分析 在GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)數(shù)據(jù)庫以“aldosterone producing adenoma(APA)”為關鍵詞搜索相關基因表達數(shù)據(jù)，下載數(shù)據(jù)并利用R軟件以P<0.05和靶點差值倍數(shù)(log2FC)>1為篩選標準進行差異基因分析。為明確作用靶點參與的信號轉導過程，應用R程序的“org.Hs.eg.db”功能對其進行ID轉換并采用京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)分析其參與的通路過程；使用“pathway”功能對富集得到的通路進行下載，并分析通路間關系。采用Swiss Target Prediction、相似集成算法(Similarity ensemble approach，SEA)、Super-PRED數(shù)據(jù)庫(邏輯回歸機器學習模型預測)收集甘氨酸、DL-甲硫氨酸作用靶點。將甘氨酸與DL-甲硫氨酸作用靶點與Veen圖中交集靶點于Cytoscape 3.8.0軟件進行導入，分析靶點間關系并設置相關可視化參數(shù)，獲得藥物-疾病-靶點相互作用網(wǎng)絡圖。使用R Studio的“ClusterProfiler”功能對藥物可能作用靶點進行基因本體(Gene Ontology，GO)的生物過程、細胞組成與分子功能富集分析，獲得目的分子參與的病理生理過程。

2 結果

2.1 大鼠腎臟、肝臟組織學檢測空白對照組大鼠腎小管腔圓形或近似圓形，形態(tài)正常，甘草酸苷組與甘草酸苷與氨基酸復方組出現(xiàn)部分腎小管擴張，腎近曲小管上皮水腫++，提示出現(xiàn)腎損傷，而甘草酸苷與氨基酸復方組腎損傷減輕，如圖1 A～C所示。空白對照組肝細胞排列緊密，形態(tài)正常，甘草酸苷組與甘草酸苷與氨基酸復方組出現(xiàn)肝細胞空泡變性++，提示出現(xiàn)肝損傷，甘草酸苷與氨基酸復方組肝損傷減輕。證明過量甘草酸苷可導致PA，引入氨基酸后能緩解甘草酸苷導致的PA，如圖1 D～F所示。

2.2 PA代謝組學分析對代謝物進行主成分分析，觀察組間樣本的總體分布趨勢和組間樣本的差異度，經7-fold cross-validation得到的正離子PCA 模型共有3個主成分，R2X模型解釋率等于0.581 cum>0.5 cm，負離子PCA 模型共有3個主成分，R2X模型解釋率等于0.528 cum>0.5 cm，組內聚集度高，組間分離明顯，說明模型可靠，甘草酸苷組與空白對照組組間有明顯差異。經7-fold cross-validation得到的正離子PCA模型有2個主成分，R2X模型解釋率等于0.51 cum，負離子PCA 模型有3個主成分，R2X模型解釋率等于0.561 cum，組內聚集度高，組間分離明顯，說明模型可靠，甘草酸苷組與甘草酸苷與氨基酸復方組間有明顯差異。OPLS-DA可在不降低模型預測能力前提下，能夠有效減少模型復雜性與增加解釋能力。經7-fold cross-validation，甘草酸苷組與空白對照組模型正離子模型的模型預測能力Q2為0.421，見圖2A。甘草酸苷組與甘草酸苷與氨基酸復方組正離子模型的模型預測能力Q2為0.376，見圖2 B。來自不同組的樣本顯示出差異，各組樣本聚集在一起并明顯分開說明模型穩(wěn)定性好，可靠性高。

注：A、D：空白對照組；B、E：甘草酸苷組；C、F：甘草酸苷與氨基酸復方組。(A～C)大鼠腎臟HE染色圖，(D～F)大鼠肝臟HE染色圖。

圖2A 甘草酸苷組與空白對照組正離子OPLS-DA得分圖 圖2B 甘草酸苷組與甘草酸苷與氨基酸復方組正離子OPLS-DA得分圖

2.3 篩選PA差異代謝物根據(jù)OPLS-DA模型得到的變量權重值(Variable Importance for the Projection, VIP)來衡量各代謝物的表達模式對分類判別的解釋能力，以嚴格的OPLS-DA VIP>1和P<0.05為顯著性差異代謝物篩選標準。如表2所示，甘草酸苷組與空白對照組的總差異代謝物數(shù)量為12種；如表3所示，甘草酸苷組與甘草酸苷與氨基酸復方組的總差異代謝物數(shù)量為9種。

2.4 PA差異代謝物代謝通路分析將篩選的差異代謝物合并后，選擇差異代謝物數(shù)量大于5的KEGG代謝通路取交集。甘草酸苷組與甘草酸苷與氨基酸復方組差異代謝物的變化影響包括脂肪酸生物合成、ABC轉運蛋白、甘氨酸-絲氨酸-蘇氨酸代謝等信號通路。

2.5 轉錄組學分析及甘氨酸、DL-甲硫氨酸作用機制分析

2.5.1 APA差異基因分析 通過轉錄水平研究患者醛固酮升高的機制，對APA患者(GSE156931)差異基因分析發(fā)現(xiàn)733個基因下調，809個基因下調。APA患者基因差異較大以低表達為主，如圖3所示。對基因表達差異較大的分子以熱圖的形式展示，結果發(fā)現(xiàn)樣本分離度較好，無離散型樣本，差異分子穩(wěn)定表達，其中APA患者MYB、PPY、DDC的轉錄水平高表達，SCG2、PENK、CHGA、PNMT、DBH表達量降低，如圖4所示。

2.5.2 差異基因功能學分析 使用R軟件對差異基因進行GO富集功能分析，發(fā)現(xiàn)這些基因參與著神經元投射發(fā)育的調節(jié)、化學突觸傳遞的調節(jié)與跨突觸信號的調節(jié)等生物過程；調節(jié)著細胞組分；具有受體配體活性、G蛋白偶聯(lián)受體結合與鈣調素結合等分子功能，見圖5。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，APA患者的神經活性配體-受體相互作用、鈣信號通路、軸突導向與Wnt信號通路等通路發(fā)生了變化如圖6所示?；蚣患治?GSEA)發(fā)現(xiàn)患者的TNF-α/NFκB和胰島β細胞被抑制，如圖7所示。

表2 甘草酸苷組與空白對照組顯著性差異代謝物

表3 甘草酸苷組與甘草酸苷與氨基酸復方組顯著性差異代謝物

圖3 醛固酮腺瘤患者差異基因火山圖

圖4 醛固酮腺瘤患者差異基因熱圖

圖5 醛固酮腺瘤患者差異基因GO分析圖

圖6 醛固酮腺瘤患者KEGG通路分析圖

圖 7 醛固酮腺瘤患者GSEA分析圖

2.5.3 靶點收集 為了進一步探究甘氨酸與DL-甲硫氨酸緩解APA患者醛固酮增多癥狀的機制，通過SwissTargetPrediction、SEA、Super-PRED與HT-docking收集甘氨酸238個靶點，DL-甲硫氨酸328個靶點，如圖8A所示。對三者取交集發(fā)現(xiàn)，兩種氨基酸可能通過共同作用于10個靶點調節(jié)醛固酮增多，此外，甘氨酸可通過ESR2、LDLR、CBS等靶點調節(jié)。DL-甲硫氨酸可通過DNMT1、EZH1、GRIA1等靶點調節(jié)，見圖8B所示。

2.5.4 氨基酸調控APA的功能分析及其聯(lián)合分析 為研究兩種氨基酸調節(jié)醛固酮增多的分子機制，使用R軟件對交集基因GO富集分析發(fā)現(xiàn)兩種氨基酸通過參與神經遞質受體活性、神經遞質結合、胞外配體門控離子通道活性等生物過程調節(jié)醛固酮，如圖9所示。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，兩種氨基酸的神經活性配體-受體相互作用、GnRH分泌、亞油酸代謝等信號通路發(fā)生變化，如圖10所示。

2.5.5 氨基酸調控APA的聯(lián)合分析 對兩種氨基酸與醛固酮增多癥生物過程的富集結果進行匯總，結果發(fā)現(xiàn)，氨基酸可能通過調節(jié)磷脂代謝過程的調節(jié)、類異戊二烯代謝、甘油脂類等代謝過程和胞質鈣離子濃度、鈣離子穩(wěn)態(tài)、鈣離子調節(jié)的胞吐等鈣調節(jié)過程進而改善醛固酮增多，如圖11所示。對兩種機制進行可視化分析發(fā)現(xiàn)，兩種氨基酸可能通過作用于GSTP1、LDLR等11個靶點調節(jié)多種代謝過程，如圖12所示。也可能通過調節(jié)HTR2B、P2RX7、GABBR1等7個靶點改變鈣信號級聯(lián)反應，如圖13所示。

圖8A 甘氨酸、DL-甲硫氨酸、APA交集基因圖 圖8B 氨基酸靶點網(wǎng)絡圖

圖9 氨基酸與APA交集基因的GO分析圖

圖10 氨基酸與APA交集基因的KEGG圖

圖11 氨基酸與APA生物過程聯(lián)合分析圖

圖12 氨基酸調節(jié)代謝過程的生物過程圖

圖13 氨基酸調節(jié)鈣信號通路的生物過程圖

3 討論

甘草酸苷口服后解離形成甘草酸被腸道菌群轉化成甘草次酸[8]，具有多種藥理作用被廣泛用于臨床。大劑量甘草酸導致的PA[9]越來越受到關注。機制是甘草酸苷及其代謝產物能夠抑制腎小管上皮細胞中11β-羥基類固醇脫氫酶Ⅱ[10]，抑制皮質醇向可的松的轉化，使皮質醇濃度增加，引起PA[11]。

本實驗中進行的PA大鼠腎臟、肝臟組織病理學檢測表明，過量的甘草酸苷導致了大鼠PA，引入氨基酸后緩解了上述癥狀。與空白對照組相比，通過代謝組學分析，甘草酸苷組大鼠肝臟中12種代謝物發(fā)生顯著性變化。與甘草酸苷組相比，甘草酸苷與氨基酸復方組大鼠肝臟中9種代謝物發(fā)生顯著性變化，并涉及脂肪酸生物合成、ABC轉運蛋白、甘氨酸-絲氨酸-蘇氨酸代謝等信號通路，表明氨基酸的加入可能對機體代謝有廣泛影響。

綜合文獻對以上代謝物及通路的改變進行分析，觀察到脂肪酸類代謝產物肉豆蔻酸的差異。脂肪酸廣泛參與腎臟疾病[12]、代謝類疾病[13]、心血管疾病[14]。醛固酮增多和脂質代謝有關[15]，脂質第二信使可以從多水平上調醛固酮的產生[16]。磷脂酶-C可增加磷酸肌醇和二?；视彤a生使血管緊張素Ⅱ刺激腎上腺球狀帶分泌醛固酮[17]。因此推測肉豆蔻酸可能參與脂質代謝調節(jié)醛固酮的生成。另一種差異代謝物甜菜堿上調可抑制脂肪酸合成，刺激脂肪酸氧化和脂質分泌,改善脂質代謝[18]，故緩解假性醛固酮增多癥。光色素有氧化還原酶的作用，參與著機體的氧化反應，可通過下調脂質代謝因子DGAT2等蛋白水平調節(jié)脂質氧化反應[19]；KEGG分析發(fā)現(xiàn)其參與核黃素代謝途徑，核黃素能夠影響醛固酮在腎臟中對鈉離子的重吸收作用,并對鹽皮質激素高血壓型的大鼠有抗高血壓作用[20-21]。光色素通過多途徑影響醛固酮增多。本實驗樣本量少導致代謝組學分析時OPLS-DA負離子模式打分較低，預測結果出現(xiàn)偏差，因此沒有篩選負離子模式的差異代謝物。

腎上腺分泌過多的醛固酮抑制了腎素-血管緊張素系統(tǒng)，有35 %的病例出現(xiàn)APA[22]。APA與PA發(fā)病機制相似，可通過分析APA患者差異基因的表達推測PA的發(fā)病機制。故本研究進一步分析APA患者差異表達基因，明確疾病狀態(tài)下的病理生理機制，KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)與鈣信號調節(jié)等信號通路有關。收集氨基酸與APA的交集靶點聯(lián)合分析后發(fā)現(xiàn)氨基酸通過作用于GSTP1、LDLR等11個靶點，參與多種代謝過程并調節(jié)HTR2B、P2RX7、GABBR1等7個靶點改變鈣信號通路的多機制緩解醛固酮增多。鈣離子是驅動類固醇類激素產生的關鍵第二信使，血管緊張素Ⅱ調節(jié)鈣通道，可控制醛固酮的合成與分泌[23]，HTR2B通過介導鈣通道調節(jié)醛固酮的生成[24]。氨基酸作用靶點HTR2B改變其鈣信號通路緩解APA患者醛固酮增多的癥狀。LDLR可參與脂蛋白的運輸[25]并通過介導增加透明腫瘤細胞膽固醇的形式影響APA[26]。推測LDLR參與脂代謝調節(jié)肉豆蔻酸調節(jié)醛固酮的變化。氨基酸可通過作用靶點LDLR改變其代謝通路，調節(jié)肉豆蔻酸緩解APA患者醛固酮增多的癥狀。轉錄組學數(shù)據(jù)分析時數(shù)據(jù)庫中PA的樣本較少，而APA的致病機制與PA相似，故選取APA患者進行分析。