復方甘草酸苷片中甘氨酸與DL-甲硫氨酸原料藥的理化性質及晶型穩定性的初步研究

謝湘云， 陳春麗， 張 亮， 常占瑛， 王 梅,3， 唐 城， 高曉黎,3

(1新疆醫科大學藥學院， 2新疆及中亞特色醫藥資源教育部工程研究中心， 3新疆天然藥物活性組分與釋藥技術重點實驗室，烏魯木齊 830017；4新疆特豐藥業股份有限公司，烏魯木齊 830000)

固體藥物物態可以分為晶型與無定型，研究表明晶型原料藥會受溫度、濕度、壓力、溶劑、工藝等條件影響而發生晶型轉化，不同的晶型可能會影響制劑的穩定性、質量及療效[1]。制劑質量問題的調整和解決應該首先分析原料藥的性質，其次是輔料包材的相容性，再次考慮制劑的處方工藝。在制劑研發前，缺乏科學完善的原料藥研究，隨意從市面上選用一種進行制劑的研發工作，會使得制劑的質量和安全性很難得到有效的控制[2]。復方甘草酸苷片是由甘草酸單銨鹽(Monoammonium Glycyrrhizinate，MAG)、甘氨酸(Glycine，Gly.)、DL-甲硫氨酸(DL-Methionine，Met.)組成的復方制劑，各類成分相互配伍，可用于慢性肝病、肝功能異常、濕疹、皮膚炎、斑禿等的治療[3-6]。甘草酸苷具有抑制或殺滅病毒、消炎、免疫調節等多種藥理作用[7-8]。Gly.和Met.可緩解甘草酸苷的副作用，提高肝臟解毒能力，減少過敏反應。目前對甘草酸類制劑的研究多集中在藥效藥理方面，對該制劑原料藥晶型及其晶型轉化的研究鮮有報道。研究表明Gly.和Met.均具有多晶現象，主要有α、β、γ-型等[9-13]，它們具有不同的晶癖、空間群對稱性及穩定性，更好地了解這兩種氨基酸原料藥的固態理化性質、晶型穩定性及轉化條件，對確定合適的藥用優勢晶型、儲藏條件、改進制劑工藝等方面都有重要的意義。本研究采用X-射線粉末衍射(X-ray powder diffraction，XRPD)、掃描電鏡(Scanning electron microscopy，SEM)、同步熱分析(Simultaneous thermal analytical techniques，TGA/DTG-DSC)、傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR)等多種手段對復方甘草酸苷片中的Gly.和Met.兩種氨基酸原料藥進行固體理化性質和晶型穩定性的考察，為制劑研發原料藥優勢晶型的選擇、穩定性研究及質量控制提供數據支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器STA449 F3型同步熱分析儀(德國耐馳)；IR-Prestige-21型傅里葉變換紅外光譜儀(日本島津)；JSM-7610FPLUS型掃描電子顯微鏡(日本電子)；D8型X-射線衍射儀(德國布魯克)；TYM-8型超微粉碎儀(中國濟南天宇專用設備有限公司)；HELOS/RODOS型激光粒度儀(新帕泰克公司)；DKZ-1型電熱恒溫振蕩水槽(上海精宏實驗設備有限公司)；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；DF3-2型紅外線干燥箱(北京興爭儀器設備廠)；HPP750型穩定性測試箱(德國美墨爾特有限公司)。

1.2 試藥甘氨酸(天津天藥藥業有限公司，AGLYB190114/AGLYB190442)；DL-甲硫氨酸(修正藥業集團柳河制藥有限公司，20181112/20190814/20190919)；溴化鉀(上海阿拉丁試劑有限公司，C1911010)。

2 方法

2.1 Gly.和Met.原料藥的固態理化性質表征

2.1.1 X-射線粉末衍射(XRPD)分析 分別取Gly.和Met.原料藥，過100目藥典篩。采用CuKα靶，以步長0.01°/s的速度掃描，管電壓/管電流：40 kV/40 mA，衍射角范圍為5°～80°，分別對兩種原料藥進行XRPD分析。

2.1.2 掃描電鏡(SEM)分析 分別取少量Gly.和Met.原料藥噴金處理后，采用JSM-7610F plus掃描電子顯微鏡，在低真空模式下，以加速電壓5 KV，放大不同倍數分別對Gly.和Met.原料藥表面狀態進行觀察。

2.1.3 粒徑分布 分別取1.0 g Gly.和Met.原料藥粉末，采用干法測試，光學濃度5%～10%，分散壓力1 bar，進樣速率40%，抬升高度1.5 mm，每個樣品進行3次獨立的檢測，數據處理采用Fraunhofer理論的FREE模式。

2.1.4 同步熱分析(TGA/DTG-DSC) 分別取Gly.和Met.原料藥，采用Al2O3坩堝，升溫區間：室溫～900℃，N2氣，流速50 mL/min，升溫速率為10℃/min。

2.1.5 傅里葉紅外光譜(FTIR)分析 分別稱取Gly.和Met.原料藥2 mg，加入烘干(105℃，烘干6 h以上)后的KBr 200 mg，在瑪瑙研缽內研細，采用KBr壓片，在4 000～500 cm-1的范圍內采集，分辨率為2 cm-1，掃描20次，測樣前，均進行KBr空白背景掃描。

2.2 Gly.和Met.晶型穩定性考察

2.2.1 高溫試驗 分別將Gly.和Met.原料藥置于敞口潔凈稱量瓶中(厚度不超過3 mm)，60℃真空干燥箱內放置10 d，于第10 d取樣，按“2.1.1”項下條件進行XRPD分析。

2.2.2 高濕試驗 分別將Gly.和Met.原料藥置于敞口潔凈稱量瓶中(厚度不超過3 mm)，穩定性測試箱(25℃，相對濕度 75%±5%)內放置10 d，于第10 d取樣，按“2.1.1”項下條件進行XRPD分析。

2.2.3 溶劑的影響 分別將Gly.和Met.原料藥約1 g置于潔凈的錐形瓶中，加入20 mL去離子水，于60℃下75 r/min的恒溫振蕩水槽中振蕩4 h，過濾，室溫放置，析晶，將獲得的原料藥按“2.1.1”項下條件進行XRPD分析。

2.2.4 粉碎后對晶型的影響 用粉碎機在溫度<10℃條件下，分別對Gly.和Met.原料藥進行粉碎處理，獲得的粉末分別過325目篩，按“2.1.1”項下條件進行XRPD分析。

3 結果

3.1 Gly.和Met.原料藥的固態理化性質分析

3.1.1 XRPD結果分析 2個批次Gly.和3個批次Met.的XRPD圖譜如圖1所示，特征衍射峰值(2θ)及強度(I/I0)如表1所示。由圖1A可知，Gly.特征衍射峰位2θ在14.8°、19.0°、23.9°、28.4°、29.2°、29.9°、35.4°各值的±0.2°范圍內與α-型Gly.峰位一致[8]。Met.的特征衍射峰位2θ在5.6°、21.7°、22.3°、32.8°、33.8°各值的±0.2°范圍內與α-及γ-晶型主要的衍射峰一致，其中21.7°和32.8°的±0.2°范圍內的衍射峰為α-型特征峰，22.3°和33.7°的±0.2°范圍內的衍射峰為γ-型特征峰，故所考察Met.為ɑ-和γ-型混晶。由圖1B可知，3個批次的Met.主要在2、3、4和5(如圖1B所示)4個衍射峰強度有差異，各批次所含的ɑ-和γ-型比例有差異。

3.1.2 SEM結果分析 對Gly.和Met.固體粉末進行SEM掃描的結果如圖2所示。由結果可知，放大200倍后，甘氨酸為不規則塊狀，表面光滑；DL-甲硫氨酸為團聚的片狀，表面明顯吸附了很多微小顆粒，說明DL-甲硫氨酸具有一定吸附作用。

表1 Gly.和Met.的特征衍射峰位(2θ)及強度(I/I0)結果

圖1 Gly.(A)和Met.(B)的XRPD圖譜

圖2 Gly.(A)和Met.(B)的SEM圖(×200)

3.1.3 粒徑分布結果分析 Gly.和Met.的顆粒粒徑結果和累積頻度分布曲線見表2及圖3所示。通過干法測試確定Gly.和Met.原料藥粉碎80目的d10：10 μm以下；d50：60～90 μm；d90：170～240 μm。表面積平均粒徑(SMD)分別為17.22±0.22 μm和21.72±0.50 μm，體積平均粒徑(VMD)分別為71.30±0.32 μm和104.52±1.24 μm。

3.1.4 TGA/DTG-DSC結果分析 Gly.和Met.的同步熱分析結果和TGA/DTG-DSC曲線見表3及圖4所示，Gly.和Met.在230℃之前未出現任何吸熱峰和失重平臺，說明原料藥不含有溶劑或水分。由DSC曲線可知，Gly.(Tonset=232.4℃，Tpeak=257.4℃，ΔHf=773.5 J/g)出現了一個吸熱峰，該吸熱峰為Gly.的分解峰，且吸熱峰較強較尖銳，說明本品純度很高。由TGA-DTG曲線(圖4A)可知，DTG曲線出現一個峰(Tonset=240℃，Tpeak=258.6℃)對應TGA曲線的失重平臺，失重率79.5%。Met.的熱學行為與Gly.類似，由于Met存在混晶情況，本研究對兩個批次的Met.(20181112，20190814)進行了熱行為考察，由圖4B可知，兩個批次的DTG曲線均只有一個尖銳峰，對應TGA曲線的失重平臺，失重率約98%，兩個批次的DSC曲線的Tpeak(284.0℃ vs 284.9℃)和ΔHf(769.8 J/g vs 783.3 J/g)存在差異，結合XRPD分析可知，含α-型Met.越多，其Tpeak向高溫移動，ΔHf也增加。

表2 干法測試Gly. 和Met.的顆粒粒徑結果(n=3)

圖3 Gly.(A)和Met.(B)干法測試累積頻度分布曲線(n=3)

表3 Gly.和Met.的熱分析結果

注：黑色為DSC曲線，藍色為TGA曲線，橙色為DTG曲線。

3.1.5 FTIR結果分析 Gly.和Met.的FTIR如圖5所示，紅外特征衍射峰均與標準圖譜一致，其中圖5A中的911 cm-1處特征峰是α-型Gly.的特征峰(γ-型為930 cm-1)[11]，說明所測定的甘氨酸為α-型，進一步證實了XRPD的結論；圖5B為Met.特征紅外光譜圖，各特征峰與Met.標準圖譜一致，各批次特征峰位與強度基本一致，無法用FTIR分析出Met.不同晶型的差異。

3.2 晶型穩定性考察結果

3.2.1 Gly.的晶型穩定性分析 Gly.在室溫條件、高溫(60℃)與高濕(25℃，相對濕度 75%±5%)條件下放置10 d、60℃水中分散結晶、粉碎后的XRPD衍射圖如圖6所示，各條件下衍射峰位(2θ)一致，說明α-型Gly.在上述條件下晶型穩定，未發生轉晶現象。

圖5 Gly.(A)和Met.(B)的FTIR光譜圖

注：1, 室溫； 2, 高溫(60℃)放置10 d； 3, 高濕(25℃，相對濕度75%±5%)放置10 d； 4, 60℃水分散后結晶； 5, 粉碎。

3.2.2 Met.的晶型穩定性分析 Met.在室溫條件、高溫(60℃)與高濕(25℃，相對濕度75%±5%)條件下放置10 d、60℃水中分散后結晶、粉碎后的XRPD衍射線如圖7所示，在高濕(25℃，相對濕度75%±5%)條件下放置10 d后，各衍射峰位2θ與0 d一致，未發生晶型轉化；在高溫(60℃)條件下放置10 d，Met.在(21.7±0.2) °和(32.8±0.2)°處的兩個衍射峰消失，γ-型全部轉為ɑ-型；在60℃水中重新分散結晶或粉碎(<10℃)后，(22.3±0.2)°和(33.7±0.2)°的兩個衍射峰消失，ɑ-型轉為γ-型，說明Met.在高溫下(>60℃)以ɑ-型穩定，在低溫條件或重結晶后以γ-型穩定存在。

注：1, 室溫； 2, 高溫(60℃)放置10 d； 3, 高濕(25℃，相對濕度 75%±5%)放置10 d； 4, 60℃水分散后結晶； 5, 粉碎。

4 討論

本研究發現在水溶液中ɑ-型甘氨酸能自發成核和生長。固體ɑ-型甘氨酸在室溫、高溫(60℃)與高濕(25℃，相對濕度 75%±5%)條件下放置10 d或粉碎處理后，其晶型均未發生轉變。有研究表明，γ-型晶體雖然在非線性光學材料領域有巨大的應有潛力，但γ-型晶體是不容易制得，其成核和生長受到溫度、溶劑及添加劑等條件的影響[13-15]，在溫度約170℃或高溫高濕條件下，γ-型會轉化為ɑ-型，會導致甘氨酸結塊[16]。本研究結果表明ɑ-型甘氨酸原料藥在工藝處理及短期貯存過程中穩定，不易發生轉晶行為，可作為藥用優勢晶型原料藥。

本研究發現Met.存在固態轉晶和溶液介導的轉晶行為。對于溶液介導的轉晶，即使Met.處于高溫(60℃)水溶液中，重結晶后也只有γ-型晶體而沒有α-型晶體，這可能是由于α-型Met.在水中的溶解度高于γ-型[17]，γ-型Met.比α-型更易達到過飽和，γ-型晶體易發生成核和生長，說明溶液介導的轉晶可能取決于晶體的性質而不是所處的環境條件，即使處于高溫條件，也不會生成α-型晶體。Met.的溶解度依賴于pH，溶解度在等電點時最小，不同晶型溶解度的不同也會導致成核和生長速率的變化而導致形態和團聚情況的不同，需進一步對Met.的溶液介導的轉晶行為及機制作進一步的研究。對于Met.的固態轉晶，固體γ-型Met.在高溫60 ℃下會迅速轉變為α-型晶體，低溫下γ-型Met.更穩定[18]。固體Met.的晶型轉變僅由熱引起，即使從溶液中很容易得到γ-型晶體，固體γ-型晶體在高溫下也會迅速地轉變為α-型，無論晶體存在的環境如何，固態晶型轉變都可能發生，極易出現混晶情況。

在仿制制劑研發過程中，XRPD分析是一種快速、簡單、靈敏的鑒別氨基酸不同晶型的有效手段。FTIR法也可用于甘氨酸不同晶型的鑒別，910 cm-1處為α-型特征峰，930 cm-1處為γ-型特征峰，對于Met.原料藥，該法就不能很好的鑒別出不同晶型的差異。采用激光粒度儀的干法測試系統對兩個氨基酸的粒度分布進行檢測，由于原料藥均為白色粉末狀藥物材料，可以選擇通用光學參數即折射率1.523，密度默認為1來進行，研究結果表明光學濃度控制在5%～10%之間，可以得到高穩定性和重復性的結果，避免了采用濕法測試樣品在分散介質中部分溶解而改變樣品本身粒徑的風險。因此在后續制劑研發和生產過程中，可以利用XRPD和激光粒度儀的干法測試來有效地掌握原料藥的晶型和粒度分布情況。

綜上所述，通過對兩種氨基酸固態理化性質及晶型穩定性的考察，可為后續制劑研發原料藥優勢晶型的選擇與控制、儲藏條件、制劑工藝改進等提供實驗基礎，本研究采用的原料藥雖然達到了國家規定的化學標準，由于固態轉晶和溶液介導轉晶的存在，會導致原料藥物態狀態存在差異，這種差異是否會對最終制劑質量產生影響有待于進一步研究。