色素上皮衍生因子在結直腸癌中的作用

楊 鄴,文 武,張穎杰,蔣 燁,胡珊珊 ,陳鳳林

(1.成都市青白江區人民醫院消化內科,四川 成都 610300;2.成都市第二人民醫院消化內科,四川 成都 610017)

在全球范圍內結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是第三大最常見的癌癥,其死亡率排名第二[1],隨著社會經濟發展水平的提高其發病率還將繼續增加。目前國內外公認的治療手段主要包括了內鏡和手術切除,術前降期放化療,復發或轉移性結直腸癌的多學科綜合治療,靶向治療和免疫治療等[2]。局限性結直腸癌患者的5年相對存活率約90%,但是一旦發生遠處轉移則下降至14%左右[3],20%患者在初診時就已發生遠處轉移從而失去了根治性手術的機會,非手術治療對提高患者的生存率有著舉足輕重的作用。色素上皮衍生因子(pigment epithelial-derived factor,PEDF)是一種有效的血管生成抑制劑[4],抑制腫瘤相關血管生成是控制癌癥進展的一種有前景的治療方式,PEDF作為抗血管生成治療的標志物對評估腫瘤的進展和預后具有潛在的臨床價值,目前PEDF在胰腺癌、黑色素瘤等多種實體腫瘤中的抗腫瘤作用已得到證實[5,6]。本文總結了PEDF在CRC中的表達情況,分析了PEDF在結直腸癌中可能的抗腫瘤機制及治療作用,同時探討了PEDF在CRC中的研究前景。

1 PEDF概述

色素上皮衍生因子是由418個氨基酸組成的相對分子質量約為50 KDa的分泌性糖蛋白,于1989年首次在人視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細胞的條件培養基中作為一種神經元分化誘導因子被發現,是Y79視網膜母細胞瘤細胞神經元分化的誘導劑[7],它與絲氨酸蛋白酶抑制劑 (Serpin) 超家族成員具有結構和序列同源性[8]。PEDF蛋白帶有一個蛋白酶敏感暴露環的球狀構象,包含C末端的絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族反應環和N末端的促進神經活性的區域,它雖然在典型的絲氨酸蛋白酶抑制劑溶液中具有折疊的蛋白質結構,但PEDF屬于非抑制性絲氨酸蛋白酶抑制劑[9]。

1999年Dawson等[10]首次發現PEDF具有抗血管新生活性的作用。人血漿中純化的PEDF可以被蛋白激酶2(CK2)及蛋白激酶A(PKA)磷酸化,PEDF的功能受細胞外磷酸化位點調節,CK2 磷酸化的PEDF神經營養活性降低,而其抗血管生成活性顯著增加[11]。PEDF基因由SERPINF1基因編碼,最早出現在脊椎動物中,該基因的調節和生物學作用在脊椎動物中得以保留,人類PEDF基因位于第17號染色體短臂1區3帶1亞帶(17p13.1),這是一個包含一組癌癥相關基因的區域,基因全長約15.6 kb,分為了8個外顯子和7個內含子[12,13],它在哺乳動物物種的進化中顯示出了強烈的保守性,PEDF基因在眼、乳腺、宮頸、胰腺、肝臟、食管、結腸等組織中廣泛表達。

2 PEDF在各種腫瘤中的作用

PEDF在眼部黑色素瘤動物模型中抑制了抗血管生成反應從而減少了肝轉移[6],乳腺癌組織中PEDF表達下降,它與層粘連蛋白相互作用抑制了NADPH氧化酶誘導的ROS生成以及VEGF和MMP-9的表達,進而對乳腺癌的生長和轉移起抑制作用[14]。PEDF在宮頸癌組織中表達水平也下降,它通過雙重抑制PI3K/Akt信號通路降低宮頸癌HeLa細胞活性和侵襲相關蛋白的表達[15]。在胰腺癌組織中PEDF的表達與TNM分期、淋巴結有無轉移有關,它減弱了纖維炎癥反應從而限制胰腺癌的進展[5]。雖然PEDF在大部分腫瘤中表達下調并抑制腫瘤的生長及轉移,但它在部分腫瘤中也存在相反的作用。與鄰近的正常組織相比,肝細胞癌中PEDF表達增加,過表達的PEDF顯著增強了肝細胞癌體內外癌細胞的遷移和轉移[16],對于PEDF的這種相反作用,Li等[17]建立了異位腫瘤移植小鼠模型,通過 PEDF 對腫瘤血管生成和FFA代謝的雙重調節揭示了PEDF在HCC發展中相反的細胞內和細胞外功能,并表明PEDF過表達可以在早期顯著誘導肝細胞癌的生長,而在晚期則輕微降低腫瘤生長。同樣,PEDF在食管癌患者腫瘤組織和食管癌細胞中也過度表達,PEDF在食管鱗狀細胞癌中也可誘導腫瘤發生[18]。

3 PEDF在CRC中的表達情況

3.1 CRC組織中PEDF水平在患者CRC組織PEDF表達差異性相關研究中,檢測方法多種多樣,通過采用反轉錄定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)、蛋白質免疫印跡(westernblot)、免疫組化染色法(immunohistochemical staining,IHC)實驗表明,CRC組織中PEDF表達水平比癌旁組織低,且其表達與腫瘤的浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移及臨床分期呈負相關[19,20],腫瘤組織中PEDF表達的降低與生存時間的縮短顯著相關[19];利用熒光定量PCR(FQ-PCR)方法研究發現CRC組織中PEDF mRNA的表達也明顯低于相應癌旁組織,其表達與年齡、性別、腫瘤大小差異無統計學意義,早期患者CRC組織中PEDFmRNA的表達比晚期患者明顯升高,腫瘤組織中PEDF mRNA的表達量與組織分化程度呈正相關[21];此外,Harries等[22]在采用定量聚合酶鏈反應(qPCR)和IHC方法對其研究也表明PEDF在CRC細胞組織中表達下調,且隨著腫瘤分級的惡化而顯著下降,同時其研究結果還表明在轉錄分析中PEDF在女性CRC中的表達比男性高(這一結果與W?gs?ter等[23]的觀點相反),在直腸癌中的表達比結腸癌中高,在IHC中,PEDF在高分化的粘液腺癌中的表達更明顯,而在腫瘤位置的表達上并沒有明顯差異。上述研究雖然利用了不同的檢測方法,但結果都顯示PEDF在CRC組織中表達下降,這與早期W?gs?ter等[23]通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)法檢測定量研究所示的在CRC組織中的PEDF表達與配對正常組織相比并沒有顯著差異相矛盾,導致結論差異的原因需要借助后續研究進一步明確。

3.2 CRC細胞中PEDF水平在采用體外功能試驗法檢測重組PEDF處理對細胞功能的影響的研究中發現,PEDF在CRC細胞系和CRC細胞中的表達低于正常結直腸成纖維細胞[22];Ji等[19]的研究表明PEDF在正常黏膜、結直腸原發癌和結直腸腺瘤細胞的細胞質和細胞膜中均有表達,然而,PEDF在癌細胞中的表達比正常黏膜明顯下降。

3.3 CRC血液中PEDF水平2010年W?gs?ter等[23]對CRC患者組織和血漿中PEDF蛋白表達做了首次定量分析研究,研究顯示CRC患者組的血漿PEDF水平明顯低于健康對照組,健康對照組的男性血漿PEDF水平明顯高于女性,然而CRC患者的血漿PEDF水平與性別或其他臨床特征無關。其中CRC血清中PEDF的表達低于健康對照組這一結果在Ji等[19]的研究中也得到了證實,此外還發現結直腸腺瘤患者與健康對照組血清PEDF之間無顯著差異,低血清PEDF水平與TNM分期和肝轉移以及較差的總生存率相關,血清PEDF水平隨CRCTNM分期惡化而顯著降低,黏液性腺癌患者血清PEDF水平明顯高于腺癌患者。

總之,大量研究顯示PEDF在CRC組織、細胞、血液中的表達降低,并與腫瘤的惡性程度及轉移有顯著關系,這種表達的差異性可能對CRC患者的治療和預后的評估有指導意義。

4 PEDF在CRC中可能的抗腫瘤機制

4.1 降低微血管密度、抑制腫瘤血管的生成在實體瘤的發展過程中,新生血管生長是必要的。PEDF可誘導內皮細胞表達Fas配體(FasL),內皮細胞的凋亡可以通過FasL與Fas受體結合來誘導,而高濃度的抗凋亡蛋白存在于正常血管內皮細胞使得其不表達Fas受體,PEDF可選擇性抑制新生血管內皮細胞的增殖并保留預先存在的血管系統[24]。裝載在PLGA納米粒中的PEDF基因(PEDF- PGLANPs)通過降低微血管密度和抑制血管生成在體內抑制小鼠結腸癌細胞(CT26)的生長[25]。C26荷瘤小鼠模型中,裝載PEDF基因的CPPC納米顆粒(D-NPs)與負載空質粒的PEG-PLGA納米顆粒(Dv-NPs)相比,6小時內二者均在基質凝膠表面形成毛細血管樣結構,但D-NPs顯著破壞了管的形成,同時D-NPs處理的小鼠的海藻酸鹽珠中的新生血管明顯稀疏,D-NPs通過抑制內皮細胞的增殖和小管狀形成、阻斷體內外血管生成來抑制腫瘤生長和延長荷瘤小鼠的存活時間[26]。Bao等[27]基于CD31作為血管生成的生物標志物這一基礎,在注射CT26細胞的小鼠模型及肺轉移模型中研究了iRGD肽制備的腫瘤靶向PEDF-DNA脂質體(R-LP/PEDF)對血管生成的影響,經LP/PEDF和R-LP/PEDF治療后,腫瘤組織中CD31陽性細胞較少,LP/PEDF和R-LP/PEDF治療抑制了腫瘤組織的血管生成并起到了抗腫瘤的作用。此外,在荷瘤小鼠模型中PEDF+5-FU組腫瘤組織中微血管數量較對照組和5FU組明顯減少,PEDF和5-FU聯合用藥可對CT26結腸癌細胞起到協同治療作用,且效果優于單獨用5-FU[28]。總之,各項研究發現PEDF可通過降低微血管密度、抑制腫瘤血管新生起到抗CRC的作用。

4.2 抑制腫瘤細胞的增殖、誘導腫瘤細胞凋亡在體內外,PEDF-PLGANPs可誘導CT26凋亡來抑制CT26腫瘤的生長[25];在接受新輔助放療的局部晚期直腸癌研究中,PEDF可以抑制直腸癌細胞的增殖并抑制裸鼠異種腫瘤生長[29];腺病毒轉染PEDF可以增強腫瘤細胞的凋亡,抑制腫瘤細胞的生長[30]。在靜脈注射C26皮下腫瘤模型中裝載PEDF基因的CPPC納米顆粒(D-NPs)具有顯著的抗腫瘤活性并促進腫瘤細胞凋亡[26];通過誘導細胞凋亡,腫瘤靶向的PEDF-DNA脂質體(R-LP/PEDF)對轉移性CRC模型起到有效的抗腫瘤作用[27]。PEDF+5-FU組荷瘤小鼠腫瘤體積小于5-FU組,PEDF+5-FU組細胞凋亡率高于5-FU組,且抗腫瘤的效果優于5-FU組[28]。上述大量研究均表明PEDF在CRC中的抗腫瘤作用與其可以抑制腫瘤細胞的增值、誘導細胞凋亡密切相關。

4.3 防止腫瘤細胞的遷移、侵襲和轉移癌細胞的遷移和侵襲在轉移中有重要作用,大約90%的癌癥患者死于腫瘤轉移而不是原發腫瘤的生長,轉移性CRC患者預后較差。高水平的PEDF表達通過抑制局部晚期直腸癌患者的腫瘤生長和轉移來促進無病生存期時間[29];通過腺病毒轉導分泌PEDF的間充質干細胞顯著抑制了CT26結直腸腹膜癌擴散小鼠的腫瘤轉移和惡性腹水形成[30];重組PEDF治療顯著降低了CRC細胞系的CRC細胞遷移和侵襲率,使細胞粘附增加,預防CRC轉移擴散[22];并且PEDF衍生肽可降低結腸癌細胞系異種移植腫瘤的復發和轉移[31]。在CRC中,防止腫瘤細胞的遷移、侵襲和轉移是PEDF抗腫瘤的機制之一。

4.4 受體介導的信號通路血漿中PEDF可以被CK2及PKA磷酸化,其功能受細胞外磷酸化位點調節[11],在HCT116(結腸癌)異種移植模型中,三重擬磷突變體 (EEE-PEDF)可以提供比野生型PEDF(WT-PEDF)更有效的抗血管生成和抗癌活性[32];JNK1/2 和 p38α分別且彼此獨立地調節野生型PEDF及其擬磷突變體的凋亡和抗遷移活性,PEDF 的抗血管生成信號也主要通過激活p38和JNK應激相關激酶發生,與 WT-PEDF 相比,EEE-PEDF增強的抗血管生成和抗癌特性是通過與層粘連蛋白受體的更強的結合及更強的細胞內信號傳導效應實現的,JNK和p38 MAPKs信號通路差異調節PEDF的促凋亡和抗遷移活性[33]。P53信號通路參與了CRC細胞增殖、有絲分裂及細胞周期轉換的生物過程,也參與了人臍靜脈內皮細胞中 PEDF誘導的自噬[34],通過美國癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫識別與PEDF相關的基因,在所有674個預先定義的“Reactome”基因集中,在TCGA直腸癌數據集以及局限性晚期直腸癌隊列分析中PEDF的表達均與雙鏈斷裂(DSBs)修復通路呈負相關,與G蛋白激活通路呈正相關,使用在線數據庫STRING研究PEDF與相關基因之間的相互作用表明了P53是PEDF的下游基因,通過生物信息學分析研究發現PEDF通過激活P53調控雙鏈斷裂修復通路和激活G蛋白激活通路發揮抗直腸癌的作用[29]。血管生成刺激劑和抑制劑之間的不平衡可能導致新生血管形成,PEDF可以下調腫瘤細胞VEGF-A的表達和分泌[4],PEDF和VEGF是相互調控的信號,PEDF信號通路可能成為未來的一種輔助治療工具,可降低IC50劑量、不良反應和治療成本[31]。雖然CRC中介導PEDF抗腫瘤作用的信號通路機制尚未完全描述,但這仍將是一個有潛力的研究方向。

5 PEDF在CRC中的治療作用

新輔助放療可以降低II期、III期局部晚期直腸癌患者的局部復發率,PEDF可作為預測局部晚期直腸癌患者對新輔助放療反應的生物標志物[29]。對于能耐受化療的轉移性CRC患者,聯合化療是其一、二線治療[2],但腫瘤的耐藥性嚴重抑制了其治療效果,結腸癌細胞系對PEDF 衍生肽(CT/CTE)的急性和慢性暴露降低了對常規結腸直腸癌化療(如奧沙利鉑或伊立替康)的耐藥性[31]。在CRC全身化療中,5-氟尿嘧啶是重要組成部分,PEDF聯合5-FU用藥對CT26結腸癌細胞的治療有協同作用,且治療效果比單用5-FU治療更佳[28]。通過改良的雙乳液溶劑蒸發方法,將PEDF和化療藥物紫杉醇(PTX)同時封裝在同一納米顆粒中,雙載藥納米粒子(D/P-NPs)對C26和A549細胞具有增強的抗腫瘤作用,在C26皮下腫瘤模型中該種聯合療法也被證明有顯著改善抗腫瘤的作用[35]。

靶向藥物治療是適用于大多數CRC患者的一線治療,PEDF在實體腫瘤的靶向治療中已取得了一定成效。在體外,靶向癌癥的PEDF-DNA脂質體 (R-LP/PEDF) 對CRC細胞的侵襲、遷移和促凋亡具有增強的抑制作用,并且可以減少肺中的轉移性腫瘤結節、延長轉移性CRC小鼠模型的存活時間[27]。在體內抗腫瘤活性試驗中,共載索拉非尼(SORA)與PEDF基因的PEG-PLGA納米粒的抗腫瘤作用優于單載藥納米粒及游離藥物組[36]。將索拉非尼和PEDF封裝在基于PEG-PLGA 的納米粒子中獲得共包封納米粒子(Sora@PEDF-NPs),在急性毒性試驗中,Sora@PEDF-NPs 在小鼠體內的毒性低于游離 Sora[37]。

6 總結和展望

研究表明PEDF在CRC中的表達下降,它與腫瘤的惡性程度、臨床分期、遠處轉移呈負相關,PEDF可以通過降低微血管密度、抑制腫瘤血管的生成和腫瘤細胞的增殖遷移、侵襲、轉移,誘導腫瘤細胞凋亡,以及介導信號通路對CRC起到抗腫瘤的作用,同時它能降低化療藥物的耐藥性,可以作為新輔助放療反應的生物標志物,并對化療、靶向治療、基因治療起到協同增強作用,且在目前的研究中PEDF安全性良好,未發現PEDF的毒性作用。PEDF在CRC中表達水平的差異性及相關性可能為CRC患者的臨床診斷和預后判斷提供一定的指導意義,但縱觀國內外現有的研究,其研究對象多數采用細胞株、實驗動物等,且幾乎未涉及大腸息肉及腺瘤等癌前病變,后續的研究中我們可以考慮從正常組織到癌前病變再到大腸癌的PEDF表達情況著手對比分析及研究,從而評估PEDF作為CRC的診斷或評估預后的生物學因子的可行性。同時有必要對PEDF在CRC發展中的調控機制進行進一步研究,以期它可能成為CRC治療中的新靶點。