糖尿病腎病腎小管上皮細胞上皮-間充質轉化的機制研究進展

寧小婭,丁涵露

(1.遵義醫(yī)科大學,貴州 遵義 563000;2.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院腎內科,四川 成都 610072)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種世界性的健康挑戰(zhàn),其發(fā)生率在過去的數十年里迅速上升。根據國際糖尿病聯(lián)合會的數據顯示,在2021年的時候,全世界DM患者總數超過5.0億人(20～79歲人群),而預計到2045年,這一數字可能將急劇上升至接近8.0億[1]。糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是DM最常見的微血管并發(fā)癥,影響多達30%的1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)患者和40%的2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者[2]。此外,DN已成為眾多慢性腎臟病中導致終末期腎臟病(end stage renal disease,ESRD)的重要因素,給患者帶來了極大的威脅。越來越多的研究表明,腎小管損傷和進行性間質纖維化與DN的進展更為密切相關。腎小管上皮細胞(renal tubular epithelial cell,RTEC)上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)對DN患者腎纖維化的啟動和促進至關重要。現將DN中TEC的EMT的發(fā)病機理的研究進展做一綜述。

1 EMT概述

EMT是在一系列信號通路及細胞因子的刺激下,上皮細胞向間充質細胞轉變的一個極其動態(tài)的過程。其轉變的特征表現為細胞間接觸的消失,基底膜的破壞,上皮鈣黏素和緊密連接蛋白-1的喪失,蛋白質網絡的重構,還有新的間充質標志物的出現,如α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、波形蛋白、I型膠原蛋白和纖維連接蛋白等。EMT可以分為三種不同的類型:1型EMT可以促進胚胎發(fā)育和器官形成,2型EMT則可以引起炎癥和器官纖維化,而3型EMT則可以促進腫瘤的發(fā)展[3]。多項研究顯示,EMT在DN的病理中起主導作用,其中2型EMT與DN腎纖維化密切相關。

2 EMT與DN腎纖維化

進行性腎間質纖維化被認為是DN的標志性病理特征,表現為I型和IV型膠原、層粘蛋白和纖維連接蛋白等細胞外基質(extracellular matrix,ECM)蛋白成分在小球系膜和小管間質過度蓄積。肌成纖維細胞是腎間質纖維化發(fā)生演變的關鍵,它們在正常腎臟中極為罕見,因此,它們的出現可以被視為腎間質纖維化的開端。目前,肌成纖維細胞的來源仍然不完全清楚,但可能的前體細胞包括常駐間充質細胞、骨髓來源細胞、周細胞、內皮細胞和上皮細胞等。越來越多的證據表明,TEC不僅是損傷的受害者,也是腎臟疾病進展的驅動力。TEC損傷后,可能出現EMT或部分EMT、細胞周期阻滯和細胞衰老,并分泌促纖維化細胞因子,從而刺激肌成纖維細胞活化,導致纖維化的產生[4]。目前,越來越多的研究證明,TEC的EMT能夠促進ECM蛋白成分的表達,在DN間質纖維化的病理中起著關鍵作用。EMT的分子機制是十分復雜的,許多信號通路和中介物相互影響共同調節(jié)這一過程。

3 DN中EMT的不同發(fā)病機制

3.1 信號通路與EMT

3.1.1轉化生長因子-β(TGF-β)/Smad信號通路 TGF-β是一種多樣的轉化生長因子,包含三種不同的亞型:TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3,其中TGF-β1被證明是參與腎纖維化形成的關鍵因子,并被證明是EMT最有效的誘導劑。其通過Smad依賴(典型)和Smad非依賴(非典型)信號通路導致ECM過度蓄積和纖維化形成,以Smad依賴信號通路最為重要。Smad2和Smad3是TGF-β1最為重要的下游介質,它們在腎臟纖維化的發(fā)生過程中發(fā)揮著不同的生物學作用,甚至相互拮抗。Smad2通過抑制TGF-β1/Smad3信息通路,阻止了TGF-β1引起的腎纖維化,進而起到腎臟保護作用,而Smad3則可以促進腎臟纖維化的發(fā)生,加重腎臟疾病進展[5]。Smad7被稱為抑制性Smad,它是TGF-β信號轉導的負性調節(jié)因子,在腎臟保護中起著重要作用。Wang等[6]的實驗發(fā)現,下調Smad7可促進TGF-β1介導的EMT,從而加重DN的腎損害。骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bone morphogenetic protein 7,BMP7)屬于TGF-β超家族成員,它被認為是一種有效的抗纖維化因子。Peng等[7]研究發(fā)現,在DN中,BMP7可能通過下調TGF-β1/Smad3信息通路和上調Smad1/5信息通路,從而抑制EMT和ECM的沉積。

3.1.2Wnt/β-catenin信號通路 Wnt是重要的半胱氨酸糖蛋白質,它被細胞分泌到細胞外基質中,并在接觸細胞時激活受體介導的信號傳遞。Wnt信息通道包含典型的Wnt/β-catenin、非典型的Wnt/Ca2+和細胞極性通道,其中以典型的Wnt/β-catenin信息通道最為重要。 Wnt/β-catenin信號能夠刺激上皮細胞、成纖維細胞和巨噬細胞表達Snail1、Twist、基質金屬蛋白酶-7和血管緊張素等下游介質,它們參與腎纖維化的形成[8]。此外,Wnt/β-catenin信號還能通過與其他信號通路交織在一起,如TGF-β/Smad通路、Notch通路和結締組織生長因子等,促進腎間質纖維化。越來越多的證據表明,Wnt/β-catenin信息通道在DN的TEC的EMT過程中發(fā)揮著關鍵作用。He等[9]的實驗發(fā)現,Wnt/β-catenin信息通道能夠促進高糖(high glucose,HG)誘導的人近端小管上皮(HK-2)細胞EMT,而當抑制β-catenin的表達時,HK-2細胞EMT被減輕。C-反應蛋白(CRP)被證明可促進TEC的EMT,它是通過活化Wnt/β-catenin這一信號通路來實現的[10]。

3.1.3Notch信號通路 Notch信號通路是一種細胞-細胞通信機制,其通過Notch受體(Notch1-Notch4)的異常激活介導疾病的發(fā)生和發(fā)展。Notch信號在腎小球上皮細胞中的增多與蛋白尿和腎小球硬化有關,而Notch信號在TEC的增多則與腎間質纖維化密切有關。Cummins等[11]的研究證明,Notch4的過表達可增強人源性腎小管細胞系中TGF-β介導的腎纖維化,并且其在糖尿病小鼠和人的纖維化腎的腎小管中表達增加。Notch通路與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關,并對EMT的誘導起著重要作用。Li等[12]的實驗表明,當HG誘導的HK-2細胞中Notch通路成員(Notch1、Jagged-1、Notch細胞內結構域(NICD)、Hes5)水平下降時,波形蛋白和α-SMA的表達同樣也降低了,而上皮鈣黏素的表達則顯著升高。Yang等[13]的研究表明,在DN模型KKAy小鼠中,通過降低Notch1、Jagged-1和Hes1在TEC中的表達水平,可以有效阻止HG誘導EMT發(fā)生。

3.1.4其他信號通路 DN中TEC的EMT發(fā)生還與TLR4/NF-κB、ERK1/2、JAK/STAT3等信號通路有關。S100A8和S100A9是一類與免疫和炎癥反應相關的蛋白質,它們在糖尿病RTEC中表達升高。研究表明,S100A8/A9的過度表達可以活化TLR4/核因子κB(NF-κB)信號通路,促進EMT過程,導致糖尿病小鼠腎間質纖維化的發(fā)生[14]。研究表明,抗炎中成藥黃葵膠囊可以有效地控制腎臟NLRP3炎癥小體的活性,并且可以阻斷TLR4/NF-κB信號通道,從而緩解了DN模型大鼠的腎小管EMT進程[15]。ERK1/2信號通路也與腎間質纖維化相關。在鏈脲佐菌素誘導的DN中,CRP可以通過Wnt/β-catenin和ERK1/2信號通路促進EMT[10]。Gao等[16]在探討豆蔻素(CAD)在糖尿病大鼠腎損傷中的作用的研究發(fā)現,CAD通過抑制大鼠RTEC中的PI3K/AKT和JAK/STAT3信號通路,減弱了RTEC的EMT,從而減輕了糖尿病誘導的腎損傷。

3.2 炎癥與EMTDN是一種嚴重的慢性腎臟疾病,持續(xù)的微炎癥狀態(tài)在它的進展中起著核心作用。在DN中,NOD樣受體(NLRs)、Toll樣受體(TLRs)、NF-κB、JAK/STAT等炎癥信號通路上調,細胞粘附分子-1 (ICAM-1)、血管粘附蛋白-1 (VAP-1)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、白介素-1(IL-1)、IL-6、 IL-18等炎癥介質大量釋放,導致巨噬細胞、樹突狀細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞等炎癥細胞向腎間質浸潤。并且所有的這些事件形成正反饋回路,無限放大炎癥反應,從而加重腎損害[17]。此外,持續(xù)的炎癥狀態(tài)刺激大量間充質細胞轉化為肌成纖維細胞,從而導致進行性腎纖維化的發(fā)生。S100A8/A9主要由中性粒細胞和單核細胞分泌,在炎癥這一極其復雜的事件中發(fā)揮著重要作用。已有研究證明,它們可通過激活RTEC中的TLR4/NF-κB信號通路,促進EMT發(fā)生[14]。C-X3-C基序配體1(CX3CL1)已被證明參與炎癥反應。當CX3CL1的表達升高時,可通過激活RAF/MEK/ERK通路來促進高血糖或HG誘導的腎小管EMT[18]。可見,炎癥可通過單一機制或與其它信號通道相互作用,激活TEC的EMT事件。

3.3 氧化應激與EMT腎臟氧化應激通常是由誘導活性氧(reactive oxygen species,ROS)產生的促氧化酶增多和抗氧化劑耗盡共同引起。在腎臟中涉及許多生成ROS的酶系統(tǒng),其中NADPH氧化酶是最重要的貢獻者。ROS在DN的發(fā)病機制中扮演著重要角色。高血糖、高游離脂肪酸會激發(fā)NADPH氧化酶,從而生成巨量的ROS,而這部分ROS無法被抗氧化劑消除,從而引起炎癥細胞的大規(guī)模集聚,進而促進炎癥細胞因子、生長因子和轉錄因子生成,加劇了DN腎纖維化的發(fā)生。ROS在DN的EMT過程中起著重要作用。Lu等[19]的研究證明,HG通過增加正常大鼠腎小管上皮細胞系(NRK-52E)內ROS的產生促進TGF -β1的表達,并激活PI3K/Akt信號通路,導致雷帕霉素靶點(mTOR)磷酸化,促進腎小管EMT發(fā)生。發(fā)育調控和DNA損傷應答1(regulated in development and DNA damage response 1,REDD1)是新發(fā)現的缺氧誘導因子-1(HIF-1)的靶基因。Mu等[20]的研究發(fā)現,REDD1在DN患者和糖尿病小鼠的腎臟中表達增加,其缺失顯著抑制了糖尿病小鼠的凋亡和EMT。該研究進一步通過體外實驗表明,HG可誘導內源性REDD1與硫氧還蛋白相互作用蛋白形成強大的復合物,通過抑制ROS的產生來阻止HG誘導的細胞凋亡和EMT。

3.4 自噬與EMT自噬是一種復雜的多步驟過程,它通過溶酶體依賴的機制降解受損蛋白和大分子,以保持細胞內的平衡與穩(wěn)定。在正常情況下,足細胞具有較高的自噬水平,但如果自噬水平不足,就會增加腎小球疾病的風險。與足細胞不同,RTEC表現出低水平的基礎自噬,以防止細胞衰老及缺血再灌注損傷。然而,持續(xù)的自噬上調將導致腎纖維化的發(fā)生。因此,在正常血糖水平下,自噬是腎臟上皮細胞的重要保護機制。在慢性高血糖的刺激下,自噬調節(jié)失常,將促進DN的發(fā)生和發(fā)展。自噬是一種生物過程,它的啟動和自噬體的形成需要許多基因組,目前已經發(fā)現了30多個自噬相關基因蛋白,它們在調控自噬流程中起著至關重要的作用。Beclin1、LC3、p62都是與自噬相關的關鍵蛋白,因此它們常被作為評估自噬的標記物。自噬活性與Beclin1、LC3II的表達水平呈正相關,而與p62的表達水平呈負相關。mTOR和AMP激酶(AMPK)是與自噬啟動相關的兩個關鍵分子。mTOR通常負責抑制自噬,而AMPK與mTOR途徑的作用相反,是自噬的一種正性調節(jié)因子。Wang等[21]在探討二甲雙胍對DN腎纖維化的影響的研究發(fā)現,在DN大鼠中,P62表達升高,LC3II/I比值降低,表現為自噬抑制。當使用二甲雙胍治療后,P62表達下降,LC3II/I比值升高,自噬顯著增加,腎組織中的纖維連接蛋白和I型膠原蛋白的表達降低。體外研究進一步發(fā)現,高血糖狀態(tài)下,在p-AMPK失活的TEC中,上皮鈣黏素的表達水平下降,α-SMA的表達水平升高。Xu等[22]的研究發(fā)現,當使用自噬激活劑(雷帕霉素)時,減弱了高糖誘導的HK-2細胞的脂質蓄積和EMT,而使用自噬抑制劑(二磷酸氯喹等)時,則加劇了脂質蓄積和EMT。該研究也發(fā)現,持續(xù)高糖誘導的自噬激活會導致HK-2細胞表現出EMT。因此,一定水平基礎的自噬激活可以抑制EMT的發(fā)生,但當自噬持續(xù)激活時,將會發(fā)生病理變化,發(fā)生EMT上調。

3.5 腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)與EMTRAS是參與血壓和鹽平衡調節(jié)的激素系統(tǒng)。它的過度激活將會構成一種致病機制,導致組織損傷和纖維化的發(fā)生。腎內的血管緊張素肽水平明顯高于血漿或其他器官組織,其中,血管緊張素II (AngII)是RAS重要生理功能的主要效應物。在慢性高血糖的刺激下,AngII在腎臟局部升高,通過誘導氧化應激、炎癥和一些生長因子及其受體的上調引起蛋白尿,最終導致小管間質纖維化。此外,AngII能顯著影響RTEC中α-SMA的表達,并且呈時間依賴性增加,通過誘導EMT促進腎纖維化的發(fā)展。這一過程主要通過TGF-β1這一關鍵介質來介導。Zhou等[23]的研究證明,HG通過使局部RAS升高后激活AT1受體,導致TGF-β1的合成增加,促進ERK1/2磷酸化,誘導RTEC發(fā)生EMT。Chen等[24]的研究發(fā)現,AngII以時間和劑量依賴的方式顯著提高各種Wnt mRNA和活性β-catenin蛋白在HK-2細胞中的表達水平。表明Wnt/β-catenin信號通路也參與AngII介導的EMT過程。

3.6 微RNAs(miRNAs)與EMTmiRNAs是一種小的非編碼RNA分子,被發(fā)現廣泛存在于哺乳動物細胞中,通常含有18～24個核苷酸,可調控人類基因組編碼的大多數基因的表達。其除了能調節(jié)腎臟發(fā)育和維持穩(wěn)態(tài)外,還能驅動包括DN在內的許多腎臟疾病的病理。miRNAs可以通過調節(jié)EMT來影響DN的結局。大部分miRNAs通過影響TGF-β信號轉導途徑來參與DN的EMT過程。Wang等[25]的實驗發(fā)現,在NRK-52E中,TGF-β1和TGF-β2均可使miR-200a的表達水平降低,從而Smad-3的活性被減弱,導致TGF-β引起的EMT得到減輕。該研究還發(fā)現,miR-141和miR-200a均可抑制TGF-β2的表達,從而間接影響TGF-β1的表達水平。因此,miR-200a和miR-141既可作為TGF-β信號的下游介質,也可作為反饋調節(jié)介質來影響TGF-β依賴的EMT。Sun等[26]的研究發(fā)現,在TGF-β1處理HK-2細胞和糖尿病OLETF大鼠的腎皮質中,miR-133b和miR-199b表達水平顯著上升。當它們被抑制后,可有效緩解TGF-β1誘導的HK-2細胞和糖尿病OLETF大鼠的EMT和腎纖維化,這個過程被證明通過激活Sirt1實現。除TGF-β信號通路外,PI3K/AKT通路是miRNAs影響的另一常見通路。有研究證明,下調miR-320c導致PI3K/AKT信息通路被抑制,從而減輕了HG誘導的EMT,同時還減弱了HK-2細胞的遷移力和侵襲力[27]。

3.7 其他機制與EMT鋅指DNA/RNA結合轉錄因子陰陽1(Yin Yang 1,YY1)參與包括DM在內的多種代謝性疾病,并被證明是腎纖維化的一種新型調節(jié)因子。Yang等[28]的實驗表明,YY1在db/db小鼠及HK-2細胞中表達增加。進一步研究發(fā)現,HG通過mTORC1/P70S6K信號通路誘導YY1的過表達和核易位,并上調α-SMA的表達,隨后通過EMT相關蛋白失調而促進腎纖維化發(fā)生。因此,YY1在TEC的EMT中的重要作用不容忽視。長鏈非編碼RNA(lncRNA)在調節(jié)肌成纖維細胞活化和腎纖維化中發(fā)揮關鍵作用,被證明可促進DN腎小管發(fā)生EMT。轉移相關肺腺癌轉錄本1 (MALAT1)屬于lncRNA家族,因最早在肺腺癌中發(fā)現而得名。Zhang等[29]的研究發(fā)現,在HG刺激的HK-2細胞中,MALAT1的表達顯著增多,并導致TEC發(fā)生EMT。進一步研究證明,這個過程是通過激活Wnt/β-catenin通路來觸發(fā)的。最近的研究發(fā)現,補體系統(tǒng)可能也參與了腎小管EMT的發(fā)生。V-set免疫球蛋白結構域4 (VSIG4)是補體C3的受體。Gong 等[30]的實驗發(fā)現VSIG4在高糖刺激的HK-2細胞中上調,并誘導EMT。當VSIG4被抑制時,HG誘導的EMT進程也被抑制。進一步研究表明,VSIG4是TGF-β的下游調節(jié)因子,其通過TGF-β信號通路促進腎小管EMT。

4 展望

總之,TEC的EMT在DN腎間質纖維化的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色,為治療DN提供了一種全新的思路。在DN中,TEC發(fā)生EMT的發(fā)病機理復雜且相互交織。因此,深入探討EMT的發(fā)生機制、調理機制、以及參與其中的信息通路將促進新的治療策略的發(fā)展,為改善DN的預后創(chuàng)造更多的可能性。然而,目前關于TEC的EMT參與DN腎纖維化的研究主要集中在細胞實驗和動物實驗,未來我們需要在臨床患者中進行更多的研究。