生物醫(yī)學工程技術在螺旋神經節(jié)神經元再生中的應用研究進展

鄭莎莎,崔慶悅,齊艷茹,程 紅,魏 浩,胡揚楠,柴人杰,,4,5,6

(1.東南大學數(shù)字醫(yī)學工程全國重點實驗室,附屬中大醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,生命科學與技術學院,生命健康高等研究院,江蘇省生物醫(yī)藥高新技術研究重點實驗室,江蘇 南京 210096;2.南通大學神經再生協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南通 226001; 3.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,江蘇 南京 210008;4.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,四川 成都 610072;5.中國科學院干細胞與再生醫(yī)學研究中心,北京 100101;6.首都醫(yī)科大學北京市神經再生修復研究重點實驗室,北京 100069)

聽力損失影響患者的溝通、認知、教育甚至心理健康,對患者的生活質量有著重大影響,給社會帶來經濟負擔。在所有聽力損失中,感音神經性耳聾( sensorineural hearing loss, SNHL )是最常見的類型,占絕大多數(shù)[1]。SNHL是很常見的耳疾,全世界約有3.6億人口患有此病[2],其核心原因是耳蝸毛細胞的損傷和毛細胞損傷之后的螺旋神經元(spiral ganglion neurons, SGNs)的神經突退化和細胞死亡。人工耳蝸(Cochlear implant, CI)是目前治療重度、極重度感音神經性耳聾最有效的方法[3],但功能性螺旋神經元數(shù)量不足是影響CI植入效果的重大醫(yī)學難題[3]。因此,保護或修復受損的螺旋神經元是治療感音神經性聽力損失的有效途徑,也是聽覺再生領域的重要研究方向。生物醫(yī)學工程是近年來逐漸興起的一門交叉學科,其將工程學的技術、原理和設計概念應用于生物學和醫(yī)學,其研究目的是提高生活質量,減少疾病對個人生活的影響。生物醫(yī)學工程研究領域廣闊,包括生物材料、組織工程、生物儀器、生物信號等學科[4]。近年來,生物醫(yī)學工程技術在基礎研究方面取得了很大的成績,主要應用于骨軟骨[5]、肌肉[6]、皮膚[7]、肝臟[8]等組織的再生中,本文將介紹其在SGNs再生中的應用。

1 SGNs

耳蝸中的SGNs可分為I型SGNs和II型SGNs兩個亞組。I 型 SGNs占內耳聽覺神經元的大多數(shù),是有髓鞘的、大的雙極細胞,它們將復雜的聲學信息通過周圍樹突從內毛細胞傳遞到中樞神經系統(tǒng)[9],而II 型SGNs是無髓鞘的、小的單極細胞,支配外毛細胞和為部分支持細胞提供感覺反饋,控制聽覺上皮層對聲音信號的敏感性[10]。發(fā)育水平上,SGNs屬于終末分化細胞,不能自發(fā)增殖再生,因此SGNs的變性或者損失對聽力具有嚴重的破壞性[4],進一步導致永久性SNHL[12]。所以SGNs的修復在治療聽力障礙相關的生物醫(yī)學領域至關重要。CI是一種有效的治療手段,但限制CI有效性的因素是電極陣列和SGNs之間存在的解剖間隙,導致電流在非特異性刺激下擴散[13]。其中一個解決方法是引導SGNs的神經突向刺激電極方向生長[14]。因此,維持和促進SGNs的存活和神經突生長,并引導其向靶點方向發(fā)展,對于提高的CI表現(xiàn)至關重要。

2 生物醫(yī)學工程在SGNs再生中的應用

再生損傷的聽覺神經的傳統(tǒng)的方法包括:局部提供神經營養(yǎng)因子[15]、干細胞治療[16]、基因治療[17]等,在這些治療方法中,一種前景廣闊的聽覺神經修復方法是運用生物醫(yī)學工程中的組織工程技術。研究表明,組織工程技術可以體外模擬復雜的組織微環(huán)境,為修復損傷的組織和器官提供了一種新興方法[18]。其中,使用具有可調性和獨特性能的仿生支架進行引導神經突的生長是其方法之一[19]。

2.1 仿生支架調控仿生支架有著與天然細胞外基質(extracellular matrix, ECM)相似的特性,通過其結構和功能來指導新組織的形成[20]。理想的仿生支架應當具備生物相容性和可降解性,不會引起周圍組織的炎癥反應或者毒性反應[21],還應當為細胞提供機械和結構支持,減少神經軸突分散,以促進細胞附著、生長和增殖[2]。此外,還應該具備獨特的性質,例如能夠引導神經突生長排列,適當?shù)碾娺B接等[19]。

2.1.1導電生物材料 支架電信號是神經元與其他細胞交流的方式,這在神經發(fā)育和成熟過程中具有重要意義。基質的導電性有利于細胞間電信號的傳遞,或有效地向細胞傳遞外部電信號[22]。因此,導電生物材料在神經組織工程中得到了廣泛的應用。Hu等通過將超順排碳納米管(super-aligned carbon-nanotube sheets, SACNTs)組裝到的甲基丙烯酸酯化明膠(methacrylated gelatin, GelMA )水凝膠上來構建支架,他們制備的復合材料繼承了GelMA水凝膠的良好生物相容性和碳納米管的高導電性。研究結果表明,GelMA - SACNT促進了SGNs的定向排列和神經突的生長,同時促進了依賴鈣離子的神經元信號的傳遞[23]。在另一項研究中,他們將SACNTs集成到大藍閃蝶鱗翅上,并通過GelMA水凝膠促進SACNTs與鱗翅的結合,提高支架的生物相容性。其三維的有序拓撲結構能夠誘導SGNs的取向排列,并促進SGNs神經突的定向生長[24]。

2.1.2磁性誘導 此外,神經再生除了需要新生神經元的功能成熟外,還需要新生神經元突起的定向生長。磁性納米顆粒在外部如熱、光和磁場等刺激下,可以產生物理化學變化,已廣泛應用于生物醫(yī)學領域[25]。它們具有高穩(wěn)定性、無細胞毒性和生物相容性的優(yōu)點,在磁場下具有高磁化強度[26]。基于此,Xia等通過磁性膠體納米顆粒(Fe3O4內核和SiO2外殼)在磁場作用下的自組裝,制備了具有各向異性的磁性膠體納米鏈,并從接種的SGNs 中發(fā)現(xiàn)新生神經突起沿著納米鏈的良好取向,誘導了種子SGNs的排列,種子SGNs的生長錐發(fā)育和突觸形成得到了促進,這對再生過程中神經網絡的重排和神經信號通訊的恢復具有重要意義。值得一提的是,通過調節(jié)磁場,可以構建多向可逆的納米鏈,從而實現(xiàn)SGNs向多個方向定向排列[27]。最近的研究已經證明了另外一種磁性納米顆粒:超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide, SPIO)納米顆粒指導軸突取向的能力[28],Hu等的工作進一步證明了SPIO納米顆粒對SGNs具有良好的生物相容性,并且由SPIO納米顆粒在磁場內產生的機械張力可以促進神經元生長并引導SGNs神經突的方向,這使得操縱和定向軸突以實現(xiàn)所需的方向生長成為可能[29]。

2.1.3水凝膠支架 在生物材料中,水凝膠具有優(yōu)異的物理和化學性質,例如高度吸濕性、可調節(jié)的機械性能、以及易修飾的三維交聯(lián)網狀結構[30]。在之前的研究中,原代SGNs的細胞培養(yǎng)方案一般為二維培養(yǎng),但Yan等的研究證明三維培養(yǎng)系統(tǒng)相比較二維更有利于保存SGNs的精致結構和功能。他們利用轉基因小鼠純化SGNs群體,建立了3D基質培養(yǎng)系統(tǒng),并證明3D基質培養(yǎng)環(huán)境顯著提高SGN體外存活率,并且克服了2D系統(tǒng)的培養(yǎng)時長上限,促進了整個培養(yǎng)期間SGNs的存活,并維持了其形態(tài)結構和功能。因此三維基質培養(yǎng)環(huán)境可以作為長期培養(yǎng)純化的SGNs生理和病理研究的有用工具[12]。這些性質對于細胞的生長和成熟非常有益,也使水凝膠成為最有潛力的支架材料之一。自組裝多肽基水凝膠由于其形成的三維納米結構模仿ECM環(huán)境,并且生物活性可以被特異性地控制而受到特別關注[31]。肽基水凝膠的主要優(yōu)點包括其生物相容性、作為溶液的可注射性以及易于分子修飾。為了模擬自然的細胞環(huán)境,ECM衍生物——層粘蛋白中的生物活性表位IKVAV (Ile-Lys-Val-Ala-Val)可以共價偶聯(lián)到水凝膠形成肽上,在IKVAV -肽基水凝膠中觀察到它促進了培養(yǎng)的神經元的神經突生長[32]。這個結果強調了生物功能化多肽水凝膠在神經再生中的潛力。

2.2 電刺激調控由于CI的整體效果較好,越來越多的殘聽患者接受了CI植入,術后患者通常會保留低頻的殘余聽力。CI是電刺激的產生者,然而,關于電刺激對神經行為的影響仍存在爭議。Shen等結果表明,當電刺激強度大于50 μA或者刺激時間超過8小時后,電荷平衡雙向電刺激可顯著降低SGNs神經突的長度[33]。然而,有研究表明電刺激可以直接激活SGNs及其周圍突起[34];此外,還有動物研究表明,與未治療的對照組相比,經電刺激治療的動物的螺旋神經節(jié)神經突明顯更長[35];Scheper等的研究結果則發(fā)現(xiàn)電刺激可以提高SGNs的存活率[36]。研究結果的差異可能是由于電刺激對各種細胞行為的調節(jié)取決于細胞類型、狀態(tài)和電刺激的參數(shù)[37]。

為了深入研究電刺激對SGNs生長的調控模式,多位研究者開發(fā)了體外電刺激研究體系。Peter等所開發(fā)的刺激室和裝置用于體外電刺激參數(shù)篩選,該裝置具有一個可以改變電流幅度和脈沖寬度等參數(shù)的徑向電場的刺激室,以實現(xiàn)對SGNs的體外電刺激。研究結果提供了參數(shù)集/電荷密度,可用于體外研究電刺激對SGNs損傷的影響,并篩選保護策略,以維持和保護植入物患者的殘余聽力[38]。我們團隊開發(fā)了一種高效的CI電聲刺激(electroacoustic stimulation, EAS)系統(tǒng),并將不同的導電材料引入到該電刺激培養(yǎng)體系中,探究了該系統(tǒng)對SGNs生長發(fā)育的調控作用。我們發(fā)現(xiàn)CI/石墨烯EAS系統(tǒng)的長期刺激可促進SGNs生長錐的發(fā)育,從而促進其神經突的生長[39]。同時還發(fā)現(xiàn)該體系能夠促進神經干細胞向神經元的分化,并促進新生神經元的生長,為人工耳蝸植入與干細胞移植相結合的治療體系提供了理論基礎[40]。為了更好地模擬體內微環(huán)境,我們將導電材料MXene引入三維Matrigel基質膠中,進一步與系統(tǒng)整合構建了三維的基于人工耳蝸的電刺激系統(tǒng),并發(fā)現(xiàn)在該系統(tǒng)中低頻電刺激能夠促進SGNs神經突的生長及突觸發(fā)育,并且能夠促進由Ca2+介導的細胞間的信號傳遞[41]。相關的研究結果可能為臨床上人工耳蝸的使用提供深刻的見解,從而對SNHL患者有所幫助。此外還有諸多在動物模型上的研究表明耳蝸內慢性電刺激可減少SGNs變性[36,42,43],然而這些研究主要集中在豚鼠、大鼠和貓等小動物上,在今后的研究中,還需進一步在猴、豬等大動物模型中驗證這些電刺激模式對內耳SGNs的影響。

2.3 聯(lián)合調控策略SGNs的發(fā)育和維持結合多種治療策略,可能會取得更好的效果[44]。耳聾動物耳內外源性或轉基因神經營養(yǎng)因子如神經營養(yǎng)因子-3和腦源性神經營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)可促進SGNs神經突的再生,這些新生的神經突可能會減少CI植入電極與其靶向SGNs之間的間隙,從而提高電刺激的空間分辨率[33]。有很多研究者探究了營養(yǎng)因子和電刺激聯(lián)合調控對SGNs的影響。Shepherd等發(fā)現(xiàn)當BDNF和電刺激的聯(lián)合給藥時,對SGNs的保護效果更好[45]。CI植入是電刺激的產生者,Wey等也證明了SGNs在CI植入物上的生長將通過BDNF等刺激蛋白的分泌而增強[46]。此外,神經營養(yǎng)因子和支架的聯(lián)合作用也被討論。研究表明,用硫酸乙酰肝素(heparan sulfate, HS)和BDNF同時治療SGN外植體可促進神經突生長增強[47]。Wille等在攜帶HS涂層的可生物降解聚合物纖維中加載了BDNF,結果發(fā)現(xiàn)從纖維中遞送的BDNF大大提高了SGNs在體外的存活率,它們?yōu)檫M一步發(fā)展未來的神經元引導支架提供了有前途的基礎材料[14]。

根據(jù)近年來SGNs再生的基礎研究,可以通過干細胞的自我更新、低免疫原性、遷移能力和分化成不同類型細胞的潛力來替代SGNs不可再生的損失[40]。因此,將各種調控因素與干細胞移植有機結合可能對SGNs的再生有重大意義。Zhang等提出干細胞療法與人工耳蝸相結合可以提高人工耳蝸的性能[44]。Guo等研究表明,基于CI的EAS系統(tǒng)能夠顯著促進NSCs的向神經元的分化并促進新生神經元的成熟,暗示將人工耳蝸植入與神經干細胞轉移植相結合可能是進一步提高人工耳蝸植入效果的有效治療策略[40]。另外,將神經營養(yǎng)因子與干細胞聯(lián)合使用,能夠成功再生嚙齒動物的SGNs,這推進了CI植入技術的巨大發(fā)展[48]。綜上所述,整合多種策略的聯(lián)合調控方案可能是再生SGNs的有效手段。

3 展望

CI的出現(xiàn)已經改變了成千上萬的聽力損失患者的生活,但要想讓那些接近自然聽力的人獲得更好的結果,還需要對治療方法進行改善。利用生物醫(yī)學工程技術制備出更適合SGNs的仿生支架是一種有前景的方法,例如活體電極等;此外使用有利于SGNs生長的材料也是未來的研究方向之一,例如導電水凝膠,還可以開發(fā)新的基于肽的水凝膠,使其在生理條件下自組裝,這些水凝膠有望在SGNs和CI之間創(chuàng)建無間隙界面。此外,光學刺激被認為是傳統(tǒng)電刺激的替代方案,因為它可以克服CI電流傳播的固有限制——電流擴散引起的分辨率問題,并且可以精確地調整到模擬復雜聲音所需的頻率和強度分辨率[49]。理想情況下,這種方法將在生物醫(yī)學設計中創(chuàng)造巨大的應用價值。