外泌體在感音神經性聾中的作用研究進展

孟 雨,王 雪,陳 放,路鈞澤,王 嫚,劉聞聞

(1. 山東省耳鼻喉醫院耳鼻咽喉頭頸外科,山東大學,山東 濟南 250022;2. 山東省耳鼻喉研究所,山東 濟南 250022)

耳聾是人類最常見的感官缺陷疾病之一,據世界衛生組織最新統計,全世界有超過4.66億人患有聽力損失[1],并有發展為抑郁和癡呆等相關共病的風險[2]。感音神經性聾(sensorineural hearing loss,SNHL)的病因和發病機制復雜多樣,其主要的病理改變是耳蝸毛細胞和螺旋神經節神經元的功能異常和損傷,然而這些細胞均為終末分化細胞,損傷后難以修復再生,由此導致SNHL一旦發生即為永久性[3,4]。目前,SNHL的治療尚無有效藥物,主要基于助聽器和人工耳蝸植入等替代療法恢復部分聽力,但因可能引起異物反應和急慢性炎癥,影響其長期療效[5]。

外泌體來源廣泛、數量多并且穩定存在于幾乎所有體液中;同時具有其親本細胞的某些特征,參與多種生理和病理過程[6-8],有望成為多種疾病早期診斷的生物標志物[9],因此被稱為"液體活檢"。不僅如此,外泌體還綜合了細胞藥物遞送和納米技術的優勢,被認為是極具潛力的新型生物載體。本文主要對外泌體在感音神經性聾發生發展中的作用和潛在臨床應用價值的研究進展進行闡述。

1 外泌體

外泌體是一種由細胞內多囊體與細胞膜融合后釋放到細胞外基質的膜性囊泡,其直徑在50 ～ 150 nm,電鏡下呈凹半球狀。外泌體由幾乎所有器官來源的正常細胞和腫瘤細胞產生,并且半衰期長,可以穩定存在于幾乎所有的生物體液中。其脂質雙分子層結構可以有效保護內容物穿過血-腦屏障等生物屏障而不被體液中的酶類降解。膜內可以攜帶其來源細胞的遺傳物質如RNA、DNA、mRNA、microRNA,還含有蛋白質、脂類和代謝物等[9]。與病毒和非病毒遞送系統相比,外泌體具有包裝容量大、生物相容性、非免疫原性和先天跨過包括屏障生物膜的能力等優點,能夠更好地在細胞間傳遞遺傳物質和蛋白質等成分,促進細胞間的通信和信息傳遞[10,11]。機體微環境導致外泌體的異質性,改變外泌體數量及大小、內容物含量及功能,不同細胞來源的外泌體差異很大。研究表明,外泌體的生物發生有兩種方式:一是通過質膜或跨高爾基體網的內出芽,形成早期內體并成熟為晚期內體,最后成為細胞內多囊體。轉運到細胞膜后,多囊體與質膜融合導致外泌體釋放到細胞外。另一種機制是質膜重排導致微囊泡從細胞膜上出芽。根據來源不同,外泌體可參與生理或病理生理過程并發揮著不同的作用。例如,抗凋亡[12,13]、抗纖維化[14～16]、促血管生成[17,18]和免疫調節[19,20]作用。

2 外泌體作為內耳遞送載體

外泌體通過轉移蛋白質、核酸和代謝物等內容物介導細胞間通訊可能存在多種機制。不同來源的外泌體優先與特定類型的細胞特異性結合。這種特異性識別大部分是通過外泌體膜蛋白與靶細胞表面特異性受體識別并特異性結合,激活細胞內信號;或者外泌體膜蛋白可被細胞外的蛋白酶切割。切割后的片段可以作為可溶性配體與靶細胞表面受體結合,這一機制反過來激活靶細胞內的信號級聯反應;抑或外泌體與靶細胞膜融合,以非選擇性的方式釋放其內容物于受體靶細胞內[21]。

腺相關病毒(adeno-associated virus, AAV)載體是目前直接體內基因治療的主力,但AAV載體作為有效的基因轉移載體穿過體內生物屏障仍然存在障礙,如內耳血-迷路屏障;同時存在轉基因大小容量(～4.7 kb)限制問題,許多基因超過了AAV載體的包裝能力。有研究利用外泌體相關AAV (Exo-AAV)將基因高效遞送至內耳,用于聽力和平衡障礙的基因治療。證明了Exo-AAV與傳統AAV載體相比,在抗AAV抗體逃避和向新生小鼠內耳毛細胞遞送基因的性能等方面更具有優勢,提高了不易被傳統AAV有效轉導的內毛細胞和外毛細胞的基因轉移率。即使存在抗AAV抗體,Exo-AAV轉導細胞的能力也顯著增強。并且觀察到外泌體內和外泌體表面有多個衣殼,可以將不同的AAV載體衣殼包裝到同一外泌體中,提高多組分載體系統的效率[10,11]。

3 外泌體作為內耳疾病生物標志物

迄今為止,臨床上仍然沒有一種手段進行內耳組織活檢或血液檢測以確定病理來源、診斷SNHL的亞型,也使我們無法理解聽力損失的主動過程,限制了內耳疾病靶向治療的發展,突出了開發內耳疾病相關生物標志物的必要性[22,23]。因為內耳位置深在且結構復雜,直到2018年,才首次報道內耳來源的外泌體[24],研究者發現大鼠原代培養的內耳細胞釋放的外泌體有可能被用作反映內耳狀態的生物標志物。隨后,對出生后不同發育階段的耳蝸組織進行外泌體含量分析發現,外泌體具有與內耳和聽覺神經系統發育相關的特異性miRNA和蛋白質組圖譜[25]。2021年,有研究者首次利用人外淋巴液分離出攜帶毛細胞特異性蛋白的外泌體[22],不僅證明了外泌體在內耳外淋巴液中的存在,也提示毛細胞是外泌體的潛在來源。盡管該研究提示外泌體可能參與內耳發育,但外泌體在成人內耳中是否存在和作用機制尚不清楚。

目前已有多項研究表明,當經歷各種應激源和病理改變時,外泌體的水平同時也會波動,包括繼發于耳毒性藥物的SNHL,如順鉑誘導的細胞毒性[24,26,27]和氨基糖苷類抗生素誘導的細胞毒性[28]所在組的外泌體蛋白水平和顆粒濃度都有所降低。其中一篇報道進一步對順鉑處理小鼠分離的外泌體進行了蛋白質組學的分析,檢測到外泌體中特異性表達的蛋白質以及內耳標記物,同時發現一些與SNHL相關的蛋白質,如Tmem 33、Pgm1、Cct8等蛋白也具有顯著變化[24]。包裹在外泌體中的 microRNA結構穩定,是血漿中組織損傷的敏感生物標志物,目前眾多研究正試圖利用各種體液中的 microRNA對疾病進行診斷和預后評估。外淋巴液的miRNA表達譜可能與聽力損失的程度相關,有望在細胞和分子水平上深入了解不同內耳病理學中發生的情況[23,29,30]。

4 外泌體用于SNHL治療的潛能

獲得性SNHL的主要病理因素包括內耳缺血、缺氧、老化、噪聲、耳毒性藥物等,通過誘導細胞內信號通路、細胞器應激與炎癥相互作用,增加活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成并抑制耳蝸內抗氧化防御系統來破壞細胞氧化還原穩態,最終導致毛細胞凋亡或壞死[26,31]。研究表明,外泌體可以清除細胞內過多的ROS,遞送線粒體保護蛋白,從而提高細胞的抗氧化能力,增強細胞活力[32]。

4.1 外泌體對于耳蝸毛細胞損傷的保護和聽力修復作用小鼠內耳干細胞來源的外泌體通過將miR-182-5p遞送到慶大霉素處理的小鼠耳蝸毛細胞系細胞,調節miR-182-5p / FOXO3軸,從而改善氧化還原環境和防御氧化應激,發揮其細胞保護和抗炎的作用,保護耳蝸毛細胞對抗慶大霉素誘導的氧化應激[33]。臍帶間充質基質干細胞(umbilical cord mesenchymal stromal cell,UC-MSC)來源外泌體可通過降低腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor -α,TNF -α)和白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的表達,上調神經生長因子,發揮抗炎作用,保護外毛細胞修復聽力損失[34]。有研究進一步發現,與一般處理的骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)來源外泌體相比,缺氧預處理BMSC來源外泌體組缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)表達上調。HIF-1α可用于緩解順鉑誘導的耳毒性,增加聽覺敏感性,減少毛細胞丟失,降低氧化應激;SOD1可以降解ROS,降低順鉑誘導的耳毒性,避免毛細胞和螺旋神經節神經元的損害[27]。MicroRNA-21過表達的神經前體細胞(neural progenitor cell,NPC)來源的外泌體通過將miR-21遞送至巨噬細胞以調節炎癥細胞因子的轉錄,抑制耳蝸內的炎癥過程來預防小鼠缺血再灌注損傷引起的聽力損失[35]。有研究發現,熱休克時,內耳橢圓囊釋放攜帶熱休克蛋白70(heat shock 70-kDa protein,HSP70)的外泌體,與毛細胞上的TLR4受體結合,對暴露于新霉素的毛細胞起到一定的保護作用,抑制或耗竭攜帶HSP70的外泌體則失去了熱休克的保護作用[28]。說明HSP70可能是外泌體發揮保護作用的介質之一,這一機制強調了外泌體在氨基糖苷類抗生素致聾環境中的潛在治療用途。隨后研究發現,MSC與耳蝸外植體共培養導致外泌體中HSP70含量增加,并且能夠保護外植體免受順鉑誘導的毒性[36]。此外,熱休克預處理BMSC后衍生的外泌體HSP70降低了順鉑暴露后小鼠內耳中促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的濃度,增加了抗炎細胞因子IL-10的濃度[37],減輕了順鉑的耳毒性。

4.2 外泌體對于耳蝸螺旋神經節神經元損傷的保護作用外泌體對于聽覺神經元即螺旋神經節神經元也具有保護作用。在體外,MSC來源外泌體對T細胞和小膠質細胞具有免疫調節活性;同時,與目前效果最好的神經保護因子BDNF相比, MSC來源外泌體顯著提高了離體螺旋神經節神經元的存活率,顯示出強大的保護作用和神經再生能力[38]。而在體內實驗中,局部應用MSC 來源的外泌體于內耳可顯著減輕聽力損失,并保護聽毛細胞免受噪聲誘導的體內創傷[38]。最新研究發現,位于螺旋神經節區域的微血管的周細胞釋放含有血管內皮生長因子-A (VEGF-A )的外泌體,VEGF-A與VEGFR2 ( Flk1 )結合表達于受體細胞,包括內皮細胞和螺旋神經節神經元,控制血管和神經元的生長[39]。以人工耳蝸為基礎的電刺激可能是誘發人工耳蝸植入術后殘余聽力損失的重要原因[40]。此外,人工耳蝸植入后產生早期和慢性炎癥反應,促使電極陣列周圍耳蝸內纖維化組織沉積以及聽覺毛細胞和螺旋神經節神經元的丟失,這也會損害電極阻抗和植入后的聽力結果[40,41]。目前,首例人類病例報告了在耳蝸植入過程中局部應用同種異體人UC-MSC來源外泌體以減少電極插入引起的炎癥。術后5天內及隨訪24個月以上,未見發熱、過敏等急性全身或局部毒性反應。最重要的是,語音清晰度在第一年內得到改善,并在植入后的第二年保持不變[42]。此報告的主要缺點是來自單一患者治療的經驗,不足以進行關于安全性、效價或有效性的全面評估。

綜上,外泌體具有用于臨床診治的潛力,包括作為高效且安全的遞送載體的潛力、作為生物標志物檢測各體液中特定蛋白或miRNA的潛力、作為具有強大的抗炎抗氧化作用的內耳治療劑的潛力。外泌體的檢測及其蛋白質譜的變化可能對耳科病理,特別是內耳的治療很有幫助;也可以通過外泌體監測耳毒性藥物繼發的內耳損傷;或用于突發性SHNL患者,以幫助指導臨床治療。目前對不同內耳疾病的分子病理生理機制缺乏全面的認識,了解導致內耳損傷并誘發聽力損失的確切分子機制將加速有效精準治療的發展。盡管外泌體作為內耳治劑的潛在用途是充滿希望的,但這一領域還需要進一步的深入研究。