麻黃-細辛藥對提取物對哮喘模型小鼠氣道重塑的影響▲

陳 宏 張明浩 陳 群 宋倩男 張佩穎 趙建云 隋博文

(1 黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院兒一科，黑龍江省哈爾濱市 150040；2 黑龍江省哈爾濱市阿城區人民醫院檢驗科，黑龍江省哈爾濱市 150300；3 黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院呼吸科，黑龍江省哈爾濱市 150040)

哮喘是一種呼吸道慢性炎癥疾病，發作時主要表現為喘鳴、咳嗽、多痰、呼吸急促等癥狀，病理學檢查可見肺部炎癥細胞浸潤、上皮損傷、支氣管平滑肌過度反應、呼吸道水腫及黏液增加[1]。哮喘反復發作可導致呼吸道結構改變，最終出現纖維化及呼吸道重塑等不可逆的病理表現[2-3]。目前，臨床上常用的哮喘藥物(如糖皮質激素、支氣管擴張劑、茶堿和白三烯調節劑等)可以改善患者機體的炎癥狀態，但其對呼吸道纖維化及其重塑的影響尚不明確，且長期使用可導致患者的用藥依從性下降，療效欠佳，并有一定的不良反應[4-5]。因此，探討哮喘的輔助療法對于提高患者的療效有重要意義。中醫學認為，哮喘以咳、喘、痰為主癥，屬中醫“咳嗽”“哮喘”“痰飲”范疇，病位在肺、脾、腎三臟，尤其是肺。中醫典籍中對哮喘的描述始見于《素問·陰陽別論》，其描述“陰爭于內，陽擾于外，魄汗未藏，四逆而起，起則熏肺，使人喘鳴”。麻黃為麻黃科植物草麻黃、中麻黃或木賊麻黃的干燥草質莖，又名龍沙、狗骨、卑相、卑鹽，始載于《神農本草經》，被列為上品[6]。中醫認為麻黃性辛溫，味微苦，歸肺、膀胱經，有發汗解表、宣肺平喘、利水消腫之功效。研究發現，麻黃提取物具有緩解支氣管平滑肌痙攣的作用[7]。細辛的主要有效成分包括甲基丁香酚、γ-細辛醚、細辛素、芝麻素等，具有抗炎作用，對哮喘具有一定療效，常被用于哮喘患兒的輔助治療[8]。但麻黃和細辛對哮喘患者肺組織學的影響如何，目前尚不清楚。為此，本研究建立哮喘小鼠模型，觀察麻黃-細辛藥對提取物對哮喘小鼠肺組織病理變化、氣道炎性反應等指標的影響，以期為麻黃-細辛藥治療哮喘提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體級Balb/c小鼠30只，雌雄各半，周齡4～6(4.97±0.46)周，體質量18～22(20.05±0.86)g。小鼠由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供[許可證號：scxk(魯)20140007]。將小鼠置于12 h光暗周期中適應性喂養1周，所有小鼠均分籠喂養，自由飲食及飲水。本研究符合《實驗動物管理條例》相關規定。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器：紫外可見分光光度計(OLYMPUS公司，型號：CKX31)，熒光顯微鏡(ZEISS公司，型號：Axio Scope A1)，低溫高速離心機(Eppendorf公司，型號：5810R)，旋轉式蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠，型號：RE-52型)，酶標儀(BIO-RAD公司，型號：450 型)。

1.2.2 試劑：麻黃飲片(產地甘肅，批號：20200315)、細辛飲片(產地黑龍江，批號：20200418)均購自哈藥集團世-堂制藥廠；小鼠白細胞介素(interleukin，IL)-6 ELISA檢測試劑盒(批號：149320012)、小鼠IL-17 ELISA檢測試劑盒(批號：128450025)、兔抗人Yes相關蛋白(Yes-associated protein，YAP)多克隆抗體(批號：728109)、總RNA提取試劑盒(批號：2019-10-AP)均購自北京盒子生工科技有限公司；轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)抗體(批號：2018-2-AP)購自Santa Cruz公司；α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體(批號：12873-1-AP)購自Abcam 公司；95%乙醇、苯酚、濃硫酸(批號：202006、202007、202006)購自上海化學試劑有限公司試劑廠；兔抗小鼠β-actin抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體均購自上海榕柏生物技術有限公司(批號：20201116、20190426)。

1.3 麻黃-細辛藥對提取物的制備 取麻黃飲片3.0 kg和細辛飲片1.5 kg，先加入600 mL無水乙醇充分浸潤，再加入4.8 L無水乙醇加熱煮沸后回流提取2 h。趁熱使用3層紗布過濾，取濾渣，再用4.8 L三蒸水加熱回流提取2 h。趁熱過濾，合并2次濾液，于真空減壓濃縮罐進行減壓濃縮,干燥箱烘干成浸膏，最后冷凍干燥制成干粉，計算得到1 g干粉相當于6.34 g生藥。

1.4 分組、哮喘小鼠模型的建立及干預方法 根據隨機數字表法將30只Balb/c小鼠分為對照組、模型組、麻黃-細辛組，各10只。適應性飼養1周后開始造模。除對照組外，其他2組均按以下方法建立哮喘小鼠模型[9]：分別于實驗的第1天、第7天、第14天對小鼠進行致敏干預，即于第1天、第7天皮下注射卵清蛋白(北京索萊寶科技有限公司，批號：B20210812)10 mg和氫氧化鋁凝膠(Sigma-Aldrich Lab & Production Materials公司，批號：20483-21-2)200 mg；第14天開始，將小鼠置于30 cm×15 cm×10 cm的不完全封閉式透明容器內，將5 mL含2%卵清蛋白的水溶液放入超聲霧化器，給予小鼠霧化30 min，連續激發7 d；第21天開始給予3組小鼠連續吸入霧化激發液4 d，1次/d，30 min/次，霧化激發液為5 mL含3%卵清蛋白的水溶液。建模成功標準為：小鼠打噴嚏、抓耳撓鼻，喘息，毛發無光，活動量減少。建模期間給予對照組等量的0.9%氯化鈉霧化吸入。建模后的第18天起，每天給予各組小鼠相應藥物霧化干預，麻黃-細辛組藥物為0.08 g/kg麻黃和0.16 g/kg細辛藥對提取物+4 mL生理鹽水，對照組和模型組霧化藥物為等體積生理鹽水，均于激發試驗前1 h進行霧化干預，連續7 d，1次/d。

1.5 標本采集及觀察指標的檢測方法

1.5.1 氣道反應性：于末次治療結束待小鼠呼吸穩定后，分別給予0 mg/mL、3.125 mg/mL、6.25 mg/mL、12.5 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL倍增濃度的乙酰甲膽堿霧化吸入，且使用肺功能檢測系統測定相應乙酰甲膽堿濃度下的增強呼氣間歇值(enhance pause，Penh)。Penh=[(呼氣時間/松弛時間)-1]×(最大呼吸流量/最大吸氣量)。Penh越高說明氣道反應性越高。

1.5.2 采集標本：氣道反應性測定完成后，使用5%的水合氯醛溶液(3 mL/kg)麻醉各組小鼠，結扎左側主支氣管，經氣管插管，以4 ℃預冷的無菌平衡鹽溶液行支氣管肺泡灌洗6 次，0.5 mL/次，收集支氣管肺泡沖洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)。隨后對小鼠進行開胸手術，分別取左右肺組織，將未灌洗過的右上葉肺組織置于4%中性甲醛固定液，將右下肺組織保存于液氮。通過眼眶后靜脈叢采血獲取血液樣本。

1.5.3 肺組織形態學：取未灌洗過的右上葉肺組織置于4%中性甲醛固定液48 h，然后進行沖洗、酒精梯度脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，將切片烤干后進行脫蠟處理，之后置入不同濃度的酒精中脫水3 min，使用蘇木精染色5 min后流水清洗3次，使用鹽酸酒精分化處理30 s，充分清洗后使用0.5%伊紅液染色1～3 min，使用酒精脫水后進行脫蠟處理，使用中性樹膠封固。顯微鏡下觀察并拍照。

1.5.4 BALF的白細胞計數和分類：使用Diff-Quik染色液染色BALF細胞涂片后，光學顯微鏡下對BALF的白細胞進行分類和計數，包括嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞及單核細胞的比例。

1.5.5 BALF和血清的IL-6及IL-17水平：取1.5.2獲取的BALF，將其過200目細胞篩后離心，輕輕傾倒出BALF上清液備用。取1.5.2的眼眶血標本，于4 ℃下以300 r/min離心15 min，收集血清，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作檢測BALF和血清的IL-6及IL-17水平，于酶標儀450 nm波長處讀取各孔的吸光度值，繪制標準曲線，計算樣品濃度。

1.5.6 肺組織中YAP的表達水平：采用免疫組化染色法，取保存于液氮中的右下肺組織，加 BSA封閉液室溫反應10 min以封閉抗體；棄去多余液體，滴加兔抗人YAP多克隆抗體，利用Image-pro Plus 6.0軟件測定陽性部位吸光度值。

1.5.7 肺組織YAP mRNA的表達水平：取保存于液氮中的右下肺組織，參照TRIzol試劑(上海索寶生物科技有限公司，批號：15732-048)說明書提取肺組織總RNA，使用紫外可見分光光度法檢測RNA純度，參照反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增。引物由上海吉瑪制藥技術有限公司合成設計。YAP上游引物為5′-CCATAAGAACAAGACCACATAAT-3′，下游引物為5′-CCTCTCCTTCTCCATCTGTAGC-3′；內參β-actin上游引物為5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物為5′-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3′。反應體系為包括cDNA模板1 μL、SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、QN ROX Reference Dye 2 μL、上下游引物各1 μL、RNase-Free水5 μL，總體積20 μL。反應條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s、59 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s，共35個循環；再72 ℃延伸10 min。每份樣品設5個復孔。采用2-ΔΔCt法計算肺組織中YAP mRNA 相對表達水平。

1.5.8 肺組織TGF-β1蛋白及α-SMA的表達：稱取各組保存于液氮的小鼠右下肺組織，根據說明書配制蛋白裂解液，裂解肺組織后離心提取總蛋白，利用二喹啉甲酸法檢測蛋白濃度。取95 ℃高溫變性后的150 μg蛋白，進行SDS-PAGE以分離等量蛋白，然后將蛋白轉至PVDF膜。使用5%脫脂牛奶于4 ℃封閉PVDF膜1 h，用TBST洗膜3次，5 min/次，然后加入TGF-β1抗體、α-SMA抗體、兔抗小鼠β-actin抗體(1 ∶1 000)，4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗膜3次，5 min/次，然后加入5 μL辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體(1 ∶1 000)，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜5次，5 min/次。以β-actin為內參蛋白，顯影曝光后，利用Image-pro Plus圖像分析軟件對蛋白條帶的灰度值進行分析。

1.6 統計學分析 采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組小鼠肺組織形態學的比較 對照組小鼠肺組織結構正常，支氣管管腔內無炎癥細胞浸潤；模型組小鼠肺組織支氣管腔狹窄，管腔內出現以嗜酸性粒細胞與中性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤，平滑肌增厚；與模型組比較，麻黃-細辛組小鼠肺組織支氣管腔內有炎癥細胞浸潤，但浸潤程度較輕，支氣管管壁輕度增厚。見圖1。

圖1 3組小鼠的肺組織形態學(HE染色，×400)

2.2 3組小鼠Penh的比較 各組小鼠吸入相應濃度乙酰甲膽堿后，其他兩組小鼠Penh均高于對照組，麻黃-細辛組小鼠Penh均低于模型組(均P<0.05)。見表1。

表1 3組小鼠Penh的比較(x±s，%)

2.3 3組小鼠BALF中各類白細胞比例、IL-6及IL-17水平和血清IL-6及IL-17水平的比較 與對照組相比，其他兩組小鼠BALF中的嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞及中性粒細胞比例，以及BALF和血清的IL-6及IL-17水平均升高(均P<0.05)。與模型組比較，麻黃-細辛組BALF中的嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞及中性粒細胞比例，以及BALF和血清的IL-6及IL-17水平均降低(均P<0.05)。見表2、表3。

表2 3組小鼠BALF中各類白細胞比例的比較(x±s，%)

表3 3組小鼠BALF和血清IL-6及IL-17水平的比較(x±s，pg/mL)

2.4 3組小鼠肺組織YAP及其mRNA表達水平的比較 與對照組相比，模型組小鼠肺組織YAP及其mRNA表達水平均升高(均P<0.05)；與模型組相比，麻黃-細辛組小鼠肺組織YAP及其mRNA表達水平均降低(均P<0.05)。見表4。

表4 3組小鼠肺組織中YAP及其mRNA相對表達水平的比較(x±s)

2.5 3組小鼠肺組織TGF-β1蛋白和α-SMA表達水平的比較 與對照組相比，其他兩組小鼠肺組織TGF-β1蛋白和α-SMA表達水平均升高(均P<0.05)；與模型組比較，麻黃-細辛組小鼠肺組織TGF-β1蛋白和α-SMA表達水平均降低(均P<0.05)。見表5，圖2。

表5 3組小鼠肺組織TGF-β1蛋白和α-SMA相對表達水平的比較(x±s)

圖2 3組小鼠肺組織TGF-β1蛋白和α-SMA電泳條帶圖

3 討 論

哮喘的主要病理表現為肺部組織炎癥細胞浸潤、氣道上皮損傷、呼吸道水腫及黏液增加[10]。肺部的慢性炎癥可引起平滑肌細胞肥大和增生、杯狀細胞化生、上皮細胞脫落等變化。這些改變會導致氣管壁變厚、氣道狹窄、血管增生，引發氣道過度反應而導致呼吸困難，其中氣道狹窄是一種不可逆的病理變化[11]。目前臨床上常用的藥物，如糖皮質激素、白三烯受體拮抗藥等，能迅速控制氣道炎癥，效果良好，但是仍然存在一些弊端，如停藥后易復發，長期用藥導致全身或局部的不良反應等。哮喘，中醫稱為哮病，是以喉中哮鳴有聲、呼吸困難甚至喘息不能平臥為主癥的反復發作性肺系疾病，常因氣候突變、飲食不當、情志失調、勞累等因素引動伏痰而發，發作前多有鼻癢、噴嚏、咳嗽、胸悶等癥狀[12]。

麻黃具有發汗散寒、宣肺平喘、利水消腫之功，主治風寒感冒、胸悶喘咳、風水浮腫、哮喘。中醫認為麻黃的作用以發散與宣肺為主，如蜜麻黃可潤肺止咳，多用于表證已解的氣喘咳嗽。中藥細辛始見于《神農本草經》，為呼吸系統常用中藥，常與其他藥物配伍用于治療哮喘[13]。細辛能去風濕、泄肺破痰，主治咳逆上氣，并有抗炎、抗過敏、鎮咳、平喘、解痙等功效，臨床上將其用于治療頭痛、風濕痛、哮喘。細辛的活性成分芝麻素具有抗氧化、抗炎、抗過敏及神經保護的功效，是一種極具開發潛力的藥物[14]。《本草綱目》記載，細辛能去風濕、泄肺破痰，主治咳逆上氣。《神農本草經》與《名醫別錄》亦指出，細辛溫中下氣，能破痰利水、行氣寬中、并治喉痹，可治鼻塞、療咳嗽。本研究通過建立哮喘小鼠模型，觀察麻黃-細辛藥對提取物對哮喘小鼠癥狀的改善作用。建模后，模型組小鼠出現打噴嚏、抓耳撓鼻，喘息等癥狀，且病理組織學結果顯示小鼠肺組織支氣管管腔狹窄、平滑肌增厚，管腔內出現以嗜酸性粒細胞與中性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤，提示哮喘小鼠模型建模成功。本研究結果顯示，模型組小鼠的Penh 及BALF中的嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞比例均高于對照組，而麻黃-細辛組上述指標均低于模型組(均P<0.05)，提示麻黃-細辛藥對提取物可降低哮喘模型小鼠的氣道反應性和炎癥反應，改善其癥狀。

研究顯示，IL-17可誘導促纖維化細胞因子和促炎癥介質的分泌，如IL-6、IL-11、IL-8等，并可通過誘導自噬導致線粒體功能障礙和支氣管纖維化，在哮喘的氣道重塑中發揮重要作用[15]。TGF-β1與α-SMA均是與纖維化密切相關的因子。研究顯示，抑制TGF-β1、α-SMA的表達對氣道重塑具有一定的調控作用[16]。YAP是一種多功能的細胞內連接蛋白和轉錄共激活因子，可通過抑制Hippo信號通路，減輕氣道炎性反應、抑制氣道重塑[17]。YAP在哮喘支氣管平滑肌中表達上調，其活性與人氣道平滑肌細胞增殖密切相關[18]。本研究結果顯示，麻黃-細辛組小鼠支氣管腔內的炎癥細胞浸潤及支氣管管壁增厚程度均較模型組減輕，提示麻黃-細辛藥對提取物有助于改善哮喘模型小鼠的氣道重塑。同時，模型組小鼠BALF和血清的IL-6、IL-17水平，以及肺組織中YAP及其mRNA表達水平、TGF-β1蛋白和α-SMA表達水平均高于對照組，而麻黃-細辛組上述指標水平均低于模型組(均P<0.05)。這提示麻黃-細辛藥對提取物可能通過下調IL-17、IL-6、TGF-β1、α-SMA、YAP等因子的表達，從而抑制哮喘模型小鼠的氣道重塑。

綜上所述，麻黃-細辛藥對提取物能夠減輕哮喘模型小鼠的氣道反應性和炎癥反應，并可能通過下調IL-17、IL-6、TGF-β1、α-SMA、YAP等因子的表達而抑制哮喘模型小鼠的氣道重塑。這或可為中醫藥治療哮喘提供新的思路。