長鏈非編碼RNA調控胃癌轉移的研究進展

王林，文坤明，黃聲凱，孫躍民，3△

胃癌是人類第五大常見癌癥，死亡率位居惡性腫瘤第4位［1］。由于早期臨床癥狀不典型，大部分胃癌患者初診時已發生轉移［2］。轉移性胃癌預后較差，即使經過手術、放化療等綜合治療，患者的5年生存率仍不到50%［3］。胃癌轉移涉及復雜的侵襲-轉移級聯過程，通過獲得分子和表型的變化，癌細胞在局部侵襲周圍組織，誘導血管生成以及免疫逃逸后才能增殖，成為臨床可檢測的顯性轉移灶［4］。近年來，越來越多的長鏈非編碼RNAs（LncRNAs）被發現在生理發育和疾病發生過程中具有重要作用［5］。研究表明，LncRNAs的異常表達與包括胃癌在內的多種惡性腫瘤的生長、侵襲、轉移密切相關［6］。本文總結了LncRNAs在胃癌轉移中參與的生物學過程和作用機制，旨在為胃癌轉移的研究提供理論依據以及為臨床診斷、治療提供新方向。

1 LncRNAs參與胃癌轉移過程中的生物學作用

在侵襲-轉移級聯過程中胃癌細胞經歷上皮-間質轉化（EMT）、誘導腫瘤血管生成、免疫逃逸等生物學過程，LncRNAs在其中的調節作用十分重要，其不僅能正向促進胃癌轉移，還具有負向抑制胃癌進展的能力［6］。

1.1 LncRNAs調節EMT過程影響胃癌侵襲轉移 EMT最初是在器官發育、組織再生、傷口愈合以及器官纖維化中觀察到的生物學過程，近年來研究表明該過程有助于癌細胞轉移［7］。EMT是一個多步驟、具有可塑性和可逆性的復雜過程，在此過程中上皮細胞失去細胞間的緊密連接并經歷細胞、分子和生化的改變，特異性地引起E-鈣黏蛋白（cad）表達下調，N-cad和波形蛋白（Vimentin）表達上調，間質表型增加、上皮表型降低，細胞侵襲性及遷移能力增強［7］。EMT涉及程序調控的分子網絡十分復雜，各種細胞外刺激、經典的生長因子以及轉化生長因子（TGF）-β/Smad、WNT/β-連環蛋白（β-catenin）、Janus蛋白酪氨酸激酶（JAK）/信號轉導及轉錄激活蛋白（STAT）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶（AKT）、核因子-κB（NF-κB）信號通路等均可參與EMT發生。這些細胞信號通路的激活促使特定的EMT轉錄因子（如Snail家族、Twist家族、ZEB家族）、非編碼RNA、表觀遺傳和翻譯后修飾因子的表達，共同協調深層的基因表達重編程［8］。

研究發現，通過改變胃癌腫瘤細胞內LncRNAs的表達，可以誘導EMT重編程，進而影響轉移的發生［8］。Lnc-CTSLP4在胃癌組織中表達下調與腫瘤的局部浸潤、淋巴結轉移、TNM分期相關，AGS和MGC803細胞轉染過表達Lnc-CTSLP4載體后，細胞間質特性和侵襲遷移能力減弱；且Lnc-CTSLP4的表達升高顯著誘導了EMT的關鍵轉錄因子Snail和N-cad表達降低以及E-cad升高［9］。Liu等［10］研究表明，胃癌細胞中過表達LncRNA FGD5-AS1可誘導Smad6蛋白水平的升高，導致骨形態發生蛋白（BMP）途徑中Smad1/5/8復合物的磷酸化受到抑制，進而胃癌細胞不能向間質表型轉化，轉移能力降低。另外，LncRNA還能誘導EMT過程，促進胃癌轉移。NR2F1-AS是與EMT高度相關的LncRNA，隨著胃癌的進展，其表達量逐漸升高［11］。NR2F1-AS可誘導普列克底物蛋白同源類結構域家族B成員2（PHLDB2）的表達。PHLDB2是一種具有PH結構域的蛋白質，作為Notch通路的下游靶點在胃癌中刺激AKT信號通路誘導EMT，促進胃癌細胞的增殖、侵襲［11］。通過調控EMT影響胃癌轉移的LncRNAs還包括促進EMT的DLEU2［12］以及抑制EMT的LINC00332［13］和MIR503HG等［14］。這類RNA分子可能成為治療胃癌轉移的有效靶點。

1.2 LncRNAs調節血管生成和血管生成擬態促進胃癌轉移 腫瘤細胞向遠處的器官定植還需血管系統的支持。但在腫瘤發生的初期并沒有構建血管網絡，癌細胞的大量增殖導致實體腫瘤內部的細胞缺血、缺氧。在這樣的微環境下刺激癌細胞上調多種血管生成相關生長因子的表達并釋放到微環境中以吸引內皮細胞向腫瘤遷移，內皮細胞在接收到血管生成相關因子信號后會分泌多種酶降解毛細血管或毛細血管后小靜脈（動脈）基底膜中的蛋白質，隨后遷移到腫瘤內部并以單列的形式增殖，最終內皮細胞通過變形、融合萌發出新的毛細血管網絡［15］。新生腫瘤血管不但為癌細胞提供了必要的營養物質和氧氣，且由于腫瘤血管結構和功能的異常，血管基質不完善，易被腫瘤細胞穿透，所以這些血管網絡也為癌細胞的轉移提供了有利條件［16］。許多分子和信號通路參與了腫瘤血管生成過程，如血管內皮生長因子、成纖維細胞生長因 子-2、基質 金屬蛋白酶、LncRNAs、Wnt/βcatenin、NF-κB等信號通路［17］。Xu等［18］研究發現NEAT1促進胃癌的轉移可能是誘導了腫瘤的血管生成：在胃癌細胞系中沉默NEAT1的表達后，血小板衍生生長因子-B、血管內皮生長因子-1、前列腺素F-2等血管生成相關因子的表達也顯著降低；體外實驗表明沉默NEAT1的胃癌細胞上清培養液能夠明顯抑制人臍靜脈內皮細胞的增殖、遷移和管狀形成；在裸鼠異種移植瘤模型中，沉默NEAT1后小鼠的肝轉移率顯著降低，血管內皮細胞標志物CD31表達下調。此外，LncRNA SNHG22也可能通過誘導胃癌血管生成以提供營養和結構的支持，調節胃癌細胞的增殖和遷移［19］。

目前，靶向抗血管生成治療已成為晚期胃癌的推薦治療策略，然而療效仍十分有限。這可能是由于在抗腫瘤血管生成治療的同時，加重了低氧微環境對腫瘤的刺激，從而誘導了癌細胞血管生擬態（VM）網絡的產生。VM是由惡性腫瘤細胞直接構成的與循環系統相通的血管樣網絡，腫瘤細胞直接與血液接觸，因此更容易進入循環到達遠處組織形成轉移灶［20］。漿細胞瘤變異體易位1（PVT1）是一種研究較為廣泛的LncRNA。Zhao等［21］發現PVT1不僅可以通過誘導血管生成來加速胃癌進展，還可以誘導胃癌VM形成，過表達PVT1的小鼠異種移植瘤組織中不僅有豐富的CD31陽性的內皮細胞血管網絡，且移植瘤傾向于形成更多的VM通道。此外，采用體外基質膠培養胃癌細胞發現PVT1刺激了更多VM通道的萌發［21］。可見LncRNAs不僅可以影響胃癌的血管生成，調節VM形成也是促進胃癌轉移的重要途徑。

1.3 LncRNAs調節免疫逃逸影響胃癌轉移 腫瘤細胞生長和轉移會誘導免疫抑制，避開免疫系統的識別和攻擊。腫瘤的免疫抑制通常是誘導免疫抑制細胞聚集在腫瘤周圍，分泌免疫抑制因子從而降低腫瘤細胞的免疫耐受性，亦或誘導免疫抑制分子受體的表達促進腫瘤細胞免疫逃逸［22］。近年來，程序性死亡受體-1（PD-1）在腫瘤免疫研究領域備受關注。PD-1是在多種免疫細胞中表達的免疫球蛋白，當PD-1與其配體結合時，可激活細胞內信號通路抑制免疫細胞激活，減少免疫細胞分泌抗體和細胞因子甚至耗竭免疫細胞，從而導致抗腫瘤免疫退化。細胞程序性死亡-配體1（PD-L1）是第一個被發現的PD-1配體，除在巨噬細胞、一些激活的T細胞和B細胞表達外，其在腫瘤細胞中表現出異常高表達，被認為是促進腫瘤免疫逃逸能力的主要因素［23］。LncRNA SNHG15在胃癌中的表達水平與PD-L1呈正相關，并可促進胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移［24］。此外，有研究將過表達SNHG15的胃癌細胞以及對照細胞與外周血單個核細胞（PBMC）共同孵育后發現，過表達SNHG15的胃癌細胞凋亡率顯著降低，SNHG15促進胃癌細胞免疫逃逸［25］。LncRNA UCA1不僅可抑制miR-26a等促進胃癌細胞增殖、遷移，其上調胃癌細胞的PD-L1水平抑制宿主免疫系統也是胃癌發生轉移的關鍵步驟［26］。在腫瘤的進程中，腫瘤細胞會產生和分泌一系列有益于自身生存的信號分子以誘導免疫細胞向促進腫瘤生長、轉移的細胞亞型極化［27］。Xie等［28］發現胃癌組織中表達上調的LncRNA ANCR通過促進叉頭轉錄因子1（FoxO1）蛋白泛素化降解，抑制巨噬細胞向M1亞型極化，促進胃癌細胞轉移。目前，諸如此類的LncRNA還在不斷被發現，為胃癌的免疫治療提供新思路［29］。

2 LncRNA調節胃癌轉移的分子機制

目前，對于LncRNAs的研究仍處于初級階段，大量的LncRNAs還未被挖掘加以功能的注釋［6］。LncRNAs可通過與其他生物分子間的相互作用，在表觀遺傳、轉錄、轉錄后、翻譯以及翻譯后修飾水平調節多種生理、病理過程的發生［30］。

2.1 胃癌轉移中LncRNA與RNA相互作用 在研究胃癌轉移的分子機制時發現，LncRNAs與miRNAs相互作用構成的ceRNA網絡是重要的細胞轉移調節方式，LncRNAs以自身含有的miRNA反應元件競爭結合miRNAs并抑制后者的活性，從而調節基因的表達［31］。LncRNA SND1-IT1可競爭性結合miR-124調節Ⅳ型膠原蛋白α1（COL4A1）的表達，進而參與TGF-β對胃癌EMT的促進作用，影響胃癌轉移［32］。Huangfu等［33］發現LINC00205在胃癌中高表達，LINC00205可通過靶向結合miR-26a來加快胃癌細胞周期進程并通過EMT促進轉移。

2.2 胃癌轉移中的LncRNA與蛋白質相互作用 LncRNA以自身的特異性序列和蛋白質RNA結合域相互作用，可調節蛋白質翻譯后修飾或影響基因的表達，甚至其相互作用還可以維持各自的穩定性或直接形成復合物參與細胞生命過程。BDNF-AS是與胃癌腹膜轉移和鐵死亡相關的LncRNA，其通過與甲基化蛋白WDR5結合抑制基因的表達［34］。Huang等［34］發現在敲低BDNF-AS和WDR5的胃癌細胞中E3泛素連接酶FBXW7基因啟動子區域CpG島甲基化水平明顯降低，并伴隨FBXW7蛋白的表達下降，而過表達BDNF-AS和WDR5則觀察到相反的結果。FBXW7還可誘導鐵死亡相關蛋白電壓依賴性陰離子通道蛋白3（VDAC3）泛素化降解。當胃癌中VDAC3不能正常降解時，鐵離子、活性氧、谷胱甘肽等物質的代謝異常活躍，最終導致胃癌細胞發生轉移，產生抗鐵死亡作用［35］。

LncRNAs與蛋白結合除調控基因表達外，還可以直接調節蛋白翻譯后修飾。蛋白質泛素化廣泛參與細胞的所有生命活動，在蛋白質降解過程中起重要作用。Ou等［36］將過表達LINC00893的胃癌細胞經過轉錄組測序后對差異基因進行基因本體（GO）富集，結果顯示LINC00893可與蛋白質結合而發揮作用。隨后，使用StarBase數據庫預測到LINC00893可結合RNA結合蛋白Fox-1同源物2（RBFOX2），并用免疫共沉淀聯合免疫印跡進行了驗證。RBFOX2是多梳抑制復合物2募集到活性基因的核調節因子，以介導基因的轉錄提高相應蛋白的表達。胃癌細胞中過表達LINC00893會導致RBFOX2蛋白表達降低，此作用可被蛋白酶體抑制劑MG132拮抗。同時，泛素化測定顯示LINC00893過表達增加了胃癌細胞中泛素化RBFOX2蛋白的水平。LINC00893和RBFOX2在胃癌細胞中同時過表達時，LINC00893抑制細胞增殖、遷移和侵襲作用明顯減弱［36］。這些驗證均表明LINC00893結合并誘導RBFOX2泛素化降解可靶向EMT抑制胃癌的轉移。

在蛋白質翻譯后修飾中，LncRNA還能直接結合蛋白分子調節蛋白質的磷酸化。DNA依賴的蛋白激酶催化亞基（DNA-PKcs）是lnc-LEMGC抑制胃癌細胞轉移所必需的。然而，轉錄譜分析卻表明lnc-LEMGC并不調節DNA-PKcs的表達水平，改變lnc-LEMGC表達后DNA-PKcs蛋白總量沒有顯著差異。但是磷酸化分析發現過表達lnc-LEMGC抑制了DNA-PKcs（Ser2056）的磷酸化水平，沉默lnc-LEMGC提高了DNA-PKcs的磷酸化水平。lnc-LEMGC抑制DNA-PKcs的磷酸化后果是引起表皮生長因子受體（EGFR）通路的信號轉導受到抑制，進而影響胃癌轉移［37］。

LncRNAs作為連接或聚集多個蛋白質的分子支架，通過與蛋白結合調節蛋白分子在細胞中的定位也是LncRNA調節胃癌轉移的重要機制。如LncRNA THAP7-AS1介導Cullin蛋白4B（CUL4B）進入細胞核促進胃癌的進展，CUL4B是Cullin4B-RingE3泛素連接酶復合體的骨架蛋白，其核定位是發揮生物學功能的前提［38］。Liu等［39］發現THAP7-AS1基因5′端的1-442位核苷酸與CUL4B的核定位信號區相互作用，促進后者入核，并激活下游PI3K/AKT信號促進胃癌進展。研究發現，在胃癌中表達上調的LncRNA NR038975在過表達或敲低后的轉錄組分析中顯示與胃癌的轉移相關，通過RNA下拉、RIP、缺失映射和共定位分析表明NR038975與核因子復合體NF90/NF45間存在直接相互作用［40］。NR038975與NF90連接提高了自身序列的穩定性，NR038975作為NF90/NF45分子連接支架還穩定了NF90/NF45復合體調節胃癌轉移的能力。此外，NR038975還被胃癌細胞來源的外泌體包裹分泌到患者的外周血，在血清中表達升高，可作為胃癌的診斷標志物［40］。

3 小結與展望

盡管大量研究表明LncRNAs靶向不同的分子和信號通路影響了胃癌轉移過程中的多種生物學途徑，但LncRNAs的具體功能和調控胃癌轉移的詳細機制仍未完全明確。目前研究LncRNAs功能機制的實驗對象大部分是離體細胞，LncRNAs可否作為胃癌轉移的治療靶點尚缺乏足夠的臨床數據支撐。此外，已知與胃癌轉移相關的LncRNAs較多，如何篩選及驗證調控胃癌轉移的LncRNAs及其能否結合臨床指標建立預后預測模型，指導個體化治療都是亟待解決的問題。期望今后更多有效研究手段能被開發以揭示LncRNAs調控胃癌轉移的機制，為胃癌的診斷和治療提供新策略。