阿爾茨海默病患者血清GGT、CTHRC1表達水平檢測及臨床意義

陳俊，鄭錦豪，陳家良，陳博

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是癡呆癥的最常見的類型，截至2016年全球患病例數達4 700萬，且其發病率有不斷升高的趨勢［1］。AD的具體發病機制尚不清楚，通常認為與細胞外淀粉樣斑塊沉積、氧化應激及炎癥反應等有關。雖然近年來磁共振成像等影像技術能對沉積的β淀粉樣肽（amyloid-beta protein，Aβ）和tau蛋白進行分子成像，有助于AD的早期診斷及療效評估，但價格昂貴，臨床難以普及［2］。因此，尋找具有較高特異性的AD血清標志物具有重要的臨床意義。γ-谷氨酰轉移酶（gamma-glutamyl transferase，GGT）是一種I型γ-谷氨酰轉移酶，可催化谷胱甘肽的谷氨酰部分轉移至多種氨基酸和二肽受體，參與神經遞質代謝、一氧化氮信號傳導和氧化應激等過程的調節［3］。氧化應激損傷是AD發病的重要影響因素，GGT在AD疾病發生、發展過程中發揮重要的作用，有望成為一種新的生物標志物［4］。膠原蛋白三螺旋重復蛋白1（collagen triple helix repeat containing 1，CTHRC1）基因位于8號染色體，分子質量為30 ku，其作為一種分泌型蛋白，廣泛參與形態發生、血管重塑等病理、生理過程［5］。近年來有研究利用高通量蛋白質質譜分析發現，CTHRC1在AD患者腦脊液中表達顯著升高，可能是早期診斷AD新的標志物［6］。本研究旨在通過檢測AD患者血清GGT和CTHRC1表達水平，探討兩者的臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2020年1月—2022年1月于湖北省中醫院腦病科及浙江省中醫藥研究院中醫內科住院部診治的120例AD患者為研究對象（AD組），AD診斷標準符合中國醫師協會2018年制定的《中國癡呆與認知功能障礙診治指南》。男70例，女50例，年齡62～84歲，平均（74.08±7.19）歲；體質量指數（BMI）平均（22.43±2.04）kg/m2；病程1～6年，平均（1.79±0.52）年；受教育年限平均（6.81±2.65）年；高血壓史45例；糖尿病史33例；吸煙史（＞20包/年）34例。排除標準：合并惡性腫瘤、精神障礙性疾病等；伴顱腦外傷或腦卒中等疾病引起的認知功能損害；伴有急性感染性疾病、骨代謝性疾病等；合并肝炎、肝硬化等肝膽系統疾病。選取同期于湖北省中醫院體檢者60例為對照組，男33例，女27例，年齡63~82歲，平均（73.51±6.46）歲；BMI平均（22.01±2.15）kg/m2；受教育年限平均（7.01±2.79）年；高血壓史18例；糖尿病史15例；吸煙史19例；均無腦卒中、帕金森病、AD等疾病病史。2組性別（χ2=0.182）、年齡（t=0.518）、BMI（t=1.279）、受教育年限（t=0.469）、高血壓史（χ2=0.989）、糖尿病史（χ2=0.128）及吸煙史（χ2=0.214）差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經本院倫理委員會批準通過（倫理號：M201908011），患者家屬均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 觀察指標 收集所有研究對象的性別、年齡、BMI、吸煙史、高血壓史、糖尿病史及受教育年限等一般資料。收集AD組患者入組后第1天和對照組健康查體時實驗室檢查指標包括總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。

1.2.2 血清GGT、CTHRC1及炎性因子水平檢測 所有研究對象于清晨空腹采集靜脈血5 mL，3 000 r/min離心5 min，取上層血清待測。采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清GGT、CTHRC1及炎性因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β、IL-6水平。GGT ELISA試劑盒購自上海齊泰生物公司（貨號QT13290），CTHRC1 ELISA試劑盒購自上海瑞番生物公司（貨號RF1214），TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒購自上海江萊生物科技公司。采用免疫比濁法檢測血清超敏C反應蛋白（hs-CRP）水平，實驗步驟嚴格按照實際和說明書進行。

1.2.3 認知功能評估 2組均采用簡易智能精神狀態檢查量表（mini-mental state examination，MMSE）評估認知功能障礙程度［7］，評估內容包括記憶、定向、計算、注意、語言和視空間各項能力，總評分范圍0～30分，得分越低，患者認知功能障礙程度越嚴重。

1.3 統計學方法 采用SPSS 24.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料用表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料以例或例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Pearson相關。受試者工作特征（ROC）曲線分析血清GGT、CTHRC1單獨及聯合檢測對AD的診斷價值。利用R語言3.6.3版本中Delong檢驗比較各指標診斷AD的診斷效能差異。多因素Logistic回歸分析影響AD發生的危險因素。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組血脂和膽固醇水平比較 2組TC、TG、HDL-C及LDL-C差異均無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 2組患者血清GGT、CTHRC1、炎性因子及MMSE評分比較 與對照組比較，AD組血清GGT、CTHRC1、TNF-α、IL-6、IL-1β及hs-CRP水平升高，而MMSE評分降低（均P＜0.05），見表2。

Tab.1 Comparison of blood lipid and cholesterol levels between the two groups表1 2組血脂和膽固醇水平比較（mmol/L）

Tab.1 Comparison of blood lipid and cholesterol levels between the two groups表1 2組血脂和膽固醇水平比較（mmol/L）

均P＞0.05。

組別對照組AD組t或χ2 n 60 120 TC 3.93±0.41 4.05±0.46 1.709 TG 1.42±0.31 1.46±0.30 0.834 HDL-C 0.98±0.15 1.01±0.17 1.159 LDL-C 2.73±0.36 2.81±0.38 1.355

Tab.2 Comparison of serum levels of GGT,CTHRC1 and inflammatory factors between the two groups of patients表2各組血清GGT，CTHRC1及炎癥因子水平比較

Tab.2 Comparison of serum levels of GGT,CTHRC1 and inflammatory factors between the two groups of patients表2各組血清GGT，CTHRC1及炎癥因子水平比較

＊＊P＜0.01。

組別對照組AD組t n 60 120 GGT（U/L）23.87±6.09 47.14±7.92 19.985＊＊CTHRC1（μg/L）32.73±5.64 43.27±6.42 10.800＊＊TNF-α（ng/L）147.35±13.12 196.27±12.42 24.446＊＊組別對照組AD組t IL-6（ng/L）61.34±11.54 106.34±13.27 22.370＊＊IL-1β（ng/L）28.29±6.28 38.34±7.14 9.256＊＊hs-CRP（ng/L）1.91±0.73 5.08±0.62 30.446＊＊MMSE評分（分）28.34±1.04 15.66±3.22 29.702＊＊

2.3 AD患者血清GGT、CTHRC1表達與炎癥因子、MMSE評分的相關性 AD組患者血清GGT、CTHRC1表達與TNF-α、IL-6、IL-1β及hs-CRP水平呈正相關，與MMSE評分呈負相關（均P＜0.05），見表3。

Tab.3 Correlation of serum GGT and CTHRC1 expression with inflammatory factors and MMSE score in the AD group表3 AD組血清GGT、CTHRC1表達與炎癥因子、MMSE評分的相關性 （r）

2.4 影響AD發生的多因素Logistic回歸分析 以是否發生AD（是=1，否=0）為因變量，以TNF-α、IL-6、IL-1β、hs-CRP、GGT、CTHRC1及MMSE評分為自變量，Logistic回歸分析顯示，較高水平GGT、CTHRC1是影響AD發生的獨立危險因素，而較高MMSE評分是影響AD發生的保護因素（P＜0.05），見表4。

2.5 血清GGT和CTHRC1單獨及聯合檢測對AD的診斷價值 血清GGT、CTHRC1聯合檢測概率方程為：Log（P/1-P）=-1.754+0.251×GGT+0.298×CTHRC1。兩者聯合診斷效能優于GGT或CTHRC1單一指標（Z分別為4.370和5.657，P＜0.05），見表5、圖1。

Tab.4 Multivariate Logistic regression analysis on the occurrence of AD表4 影響AD發生的多因素Logistic回歸分析

Tab.5 Diagnostic value of serum GGT and CTHRC1 alone and in combination for AD表5血清GGT，CTHRC1單獨及聯合檢測對AD的診斷價值

Fig.1 ROC curve analysis of the diagnostic value of serum GGT,CTHRC1 alone and combined detection in AD圖1 ROC曲線分析血清GGT，CTHRC1單獨及聯合檢測對AD的診斷價值

3 討論

AD是一種中樞神經系統退行性疾病。遺傳代謝研究表明，Aβ肽的積累是AD發生、發展過程中的早期事件，Aβ肽能夠誘導組織細胞產生大量活性氧，造成氧化和抗氧化系統平衡失調，大量活性氧在造成神經細胞膜、蛋白及DNA損傷的同時還能激活機體免疫細胞，釋放TNF-α、IL-6及IL-1β等大量促炎細胞因子，引起嚴重的神經炎癥反應［8］。神經元氧化應激損傷可導致患者認知功能障礙、記憶力下降，當疾病進展時可出現較嚴重的神經精神癥狀，最終導致患者死亡［9］。因此，深入研究AD發生、發展機制，尋找影響氧化應激過程的關鍵分子標志物，有助于AD早期診治。

GGT是細胞內一種促氧化應激的因子，是氧化應激的重要標志物，參與細胞內抗氧化因子谷胱甘肽攝取和其細胞外的分解代謝過程［10］。近年來研究發現，外周血中活性氧水平升高會導致神經元細胞死亡和損傷，且其水平升高與血管性癡呆等神經系統疾病關系密切［11］。本研究結果顯示，AD患者血清GGT水平較體檢健康者升高，并且與炎性因子TNFα、IL-6、IL-1β及hs-CRP呈正相關，提示GGT可能通過促進炎性因子的表達，促進AD的疾病進展，考慮可能原因為GGT能夠降解細胞外谷胱甘肽，導致機體氧化和抗氧化系統平衡失調，產生過量TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性因子，最終導致神經細胞的氧化應激和炎癥損傷［12］。此外，有研究發現，GGT表達水平升高可通過影響鐵蛋白的表達，導致腦內鐵超載，促進AD患者疾病進展［13］。本研究中，AD患者血清GGT水平與MMSE評分呈負相關，提示血清GGT水平有助于反映AD患者認知障礙的程度，考慮原因可能為GGT的表達升高引起氧自由基的積累，導致大腦中的脂質過氧化和神經元變性，進而加重AD的疾病嚴重程度［14］。此外，GGT水平升高還可導致血管內皮細胞損傷，促進血管動脈粥樣硬化斑塊的形成，加重AD患者認知障礙損傷程度［4，15］。進一步研究發現，GGT水平升高是影響AD發生的獨立危險因素，證實了血清GGT可能是一種新的AD血清標志物，其可通過促進炎性細胞因子分泌，加重AD患者認知功能損傷。

CTHRC1是一種細胞外分泌糖蛋白，參與血管重塑、骨形成、炎癥性關節炎和癌癥進展等多種生理和病理過程［16］。AD的發生與神經元線粒體損傷及能量轉換缺陷關系密切，神經元可以將受損的線粒體轉移到星形膠質細胞進行處理和回收，受損的線粒體產生損傷相關標志物并釋放到腦脊液中。CTHRC1作為一種線粒體損傷的標志物，可能參與AD的發生、發展過程［6］。在5XFAD轉基因小鼠AD模型中研究證實，線粒體功能障礙可導致Aβ肽血管沉積，從而形成淀粉樣血管病變，導致線粒體損傷蛋白CTHRC1能夠通過血腦屏障釋放到外周血［6］。本研究顯示，AD患者血清CTHRC1表達較健康體檢者明顯升高，提示CTHRC1可能參與AD的發生。有研究發現，AD患者腦組織CTHRC1的表達與Aβ的表達呈正相關，CTHRC1可通過促進細胞外淀粉樣斑塊沉積，促進AD進展［17］。本研究進一步分析發現，血清CTHRC1表達與炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β及hs-CRP呈正相關，與MMSE評分呈負相關，表明CTHRC1表達升高可能通過加重AD患者炎癥反應，促進AD患者認知功能損傷。有研究表明，CTHRC1表達上調能夠激活經典和非經典的Wnt信號通路，促進β-連環蛋白的表達，β-連環蛋白能夠直接促進TNF-α等促炎細胞因子的表達，加重組織炎癥反應［18-19］。此外，有研究顯示，CTHRC1能夠通過激活單核巨噬細胞等免疫細胞，誘導免疫細胞分泌促炎細胞因子IL-6、IL-1β、CRP并促進組織基質金屬蛋白酶產生，導致組織炎癥性損傷［20］。目前，臨床上對AD的診斷主要根據臨床表現及神經心理量表，但早期診斷的敏感性和特異性不高。本研究中，血清GGT和CTHRC1聯合檢測對AD發生具有較高的診斷價值，臨床醫師可根據血清GGT和CTHRC1水平對AD疾病進行早期診斷及治療，以提高AD患者的生活質量，改善臨床預后。

綜上所述，GGT、CTHRC1可能通過調控炎癥反應，從而參與AD發生、發展，加重AD患者認知功能損傷，血清GGT、CTHRC1表達升高是影響AD發生的獨立危險因素，兩者聯合檢測對AD具有較高的診斷價值，但本研究樣本量有限，未對AD患者治療過程中血清動態變化進行監測，有待今后擴大樣本量進行深入研究。