外周血單核細胞DNMT1及血清IL-6在糖尿病腎臟病中的表達及意義

許莉敏，謝燕

糖尿病腎病（DKD）是由糖尿病引起的微血管并發癥，以持續白蛋白尿和腎小球濾過率降低為主要特征［1-2］。DKD是導致終末期腎功能衰竭的重要病因之一，約占所有病因的30%，在發達國家中，DKD已經成為尿毒癥發生的主要影響因素［3］。腎小球濾過率估計值（eGFR）及24 h尿白蛋白排泄率（24 h UAER）是臨床評估DKD患者腎功能及病程分期的常用指標，但2個指標對DKD疾病早期診斷價值有限。既往研究顯示，DNA甲基化與DKD有關，而DNA甲基轉移酶1（DNMT1）是DNA甲基化的主要催化酶，能夠將甲基轉移到基因組DNA胞嘧啶核苷酸，負責DNA復制后的甲基化修飾，與人類發育異常、腫瘤及糖尿病等有關［4］。白細胞介素（IL）-6是重要的促炎細胞因子，可通過結合細胞表面的IL-6受體α，促進組織炎癥反應的發生。研究表明，DNMT1能夠促進脂多糖誘導的促炎細胞因子如IL-6和IL-8的表達，從而激活組織炎癥反應，加速DKD的疾病進展［5］。本研究旨在探討不同疾病嚴重程度的DKD患者DNMT1和IL-6的水平差異及其在DKD診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1月—2021年4月于蘇州大學附屬第一醫院就診的DKD患者150例（DKD組），DKD診斷標準符合《中國糖尿病腎臟疾病防治臨床指南》［6］。納入標準：心、腎、肺等重要臟器功能良好；溝通能力良好，可獨立完成研究；配合醫師治療。排除標準：1型糖尿病、肝源性糖尿病、應激性糖尿病、胰源性糖尿病及生長抑素瘤、醛固酮瘤等導致的糖尿病；合并血液性系統疾病；合并精神疾病；妊娠期；長期酗酒；臨床資料不完整致分組復雜性增加的患者；本研究期間正在接受其他研究的患者。另選取同期健康體檢者50例為對照組，2組研究對象的年齡、體質量指數（BMI）、性別、文化程度和吸煙史（目前正在吸煙或持續吸煙史≥6個月且≥1支/d）差異均無統計學意義（P＞0.05），見表1。本研究嚴格按照《赫爾辛基宣言》中的醫學研究倫理原則（倫理批號：TJ?IRB20191222）。

1.2 研究方法

1.2.1 觀察指標 收集DKD患者入院后及對照組健康查體時的總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、血肌酐、空腹血糖等實驗室檢查指標。應用改良的MDRD公式計算eGFR=186×（血肌酐/88.4）-1.154×年齡-0.203×0.742（女性）。放射免疫法檢測24 h UAER。微柱層析法測定糖化血紅蛋白。

Tab.1 Comparison of baseline data between the two groups表1 2組基線資料比較

1.2.2 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測IL-6水平 清晨空腹狀態下抽取靜脈血4 mL并置于無菌真空促凝管中，常溫放置20 min，3 000 r/min離心15 min，離心半徑11 cm，上清液置于-80℃冰箱保存。ELISA法檢測血清IL-6水平，試劑盒購自武漢基因美科技有限公司。

1.2.3 實時熒光定量PCR法檢測DNMT1表達 清晨空腹狀態下抽取靜脈血4 mL后加入3.8%的枸櫞酸鈉抗凝，通過Ficoll淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，置于-80℃保存待用。采用Trizol試劑提取的外周血單個核細胞中總RNA，將總RNA反轉錄為cDNA。PCR總反應體系（20μL）：cDNA 2μL，上、下游引物各1μL和SYBR Premix 10μL，雙蒸水6μL。引物合成由上海賽百盛公司完成。DNMT1引物：上 游 5′-TCAGTCGCAAGATGAAGCGT-3′，下 游 5′-CCCCAGTCAAACTACCCACC-3′；內參β-actin：上游5′-GT?GGGGCGCCCAGGCACCT-3′，下游5′-CTTCCTTAATGTCAC?GCACGATTG-3′。采用2-ΔΔCt法計算DNMT1的相對表達量。

1.4 統計學方法 采用SPSS 23.0統計軟件進行數據分析。正態分布計量資料用表示，2組間均數比較采用兩獨立樣本t檢驗。采用Pearson相關分析。多因素Logistic回歸分析影響DKD發生的危險因素并建立24 h UAER、IL-6、DNMT1聯合診斷評估模型。受試者工作特征（ROC）曲線分析24 h UAER、IL-6、DNMT1及三者聯合檢測在DKD中的診斷價值，利用R軟件包3.6.3版本比較各指標曲線下面積（AUC），比較采用DeLong′s test檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組實驗室指標比較 與對照組比較，DKD組空腹血糖、IL-6、DNMT1、血肌酐、24 h UAER、LDLC、糖化血紅蛋白水平升高，而eGFR、HDL-C水平降低（均P＜0.05），2組的總膽固醇、三酰甘油差異無統計學意義，見表2。

Tab.2 Comparison of laboratory indexes between the DKD group and the control group表2 DKD組和對照組實驗室指標比較

Tab.2 Comparison of laboratory indexes between the DKD group and the control group表2 DKD組和對照組實驗室指標比較

＊＊P＜0.01；eGFR單位為mL/（min·1.73 m2）。

組別對照組DKD組t n 50 150空腹血糖（mmol/L）4.91±0.52 10.80±2.30 17.928＊＊IL-6（μg/L）52.23±3.17 70.05±4.01 28.571＊＊DNMT1 0.07±0.02 0.13±0.03 13.188＊＊血肌酐（μmol/L）62.14±10.55 91.74±22.98 8.793＊＊eGFR 104.89±14.62 80.17±10.82 12.749＊＊24 h UAER（mg）5.12±1.62 604.29±107.63 39.297＊＊總膽固醇（mmol/L）4.68±0.82 4.42±0.93 1.761三酰甘油（mmol/L）1.83±0.62 2.01±0.83 1.407 HDL-C（mmol/L）1.42±0.24 1.19±0.23 6.057＊＊LDL-C（mmol/L）2.41±0.75 3.61±0.86 8.180＊＊糖化血紅蛋白（%）0.67±0.08 9.08±1.12 52.963＊＊

2.2 DKD患者IL-6、DNMT1與其他臨床指標的相關性 DKD組患者IL-6與DNMT1呈正相關（r=0.560，P＜0.05）。IL-6、DNMT1與24 h UAER呈正相關（均P＜0.05），與空腹血糖、糖化血紅蛋白、血肌酐、eGFR、HDL-C、LDL-C均無相關性（均P＞0.05），見表3。

Tab.3 Correlation of IL-6,DNMT1 and clinical indicators in DKD patients表3 DKD患者IL-6、DNMT1與臨床指標的相關性

2.3 DKD影響因素分析 以是否發生DKD為因變量（是=1，否=0），以eGFR、24 h UAER、IL-6及DNMT1為自變量，Logistic回歸分析結果顯示，較高水平的24 h UAER、IL-6、DNMT1是影響DKD發生的獨立危險因素（P＜0.05），見表4。

Tab.4 Analysis of influencing factors of DKD表4 DKD影響因素分析

2.4 24 h UAER、IL-6、DNMT1對DKD的診斷價值 24 h UAER、IL-6、DNMT1聯合檢測診斷DKD的 方 程 為：Log［P/（1-P）］=-1.867+0.258×（24 h UAER）+0.298×（IL-6）+0.776×（DNMT1）。聯合檢測診斷DKD的AUC高于24 h UAER、IL-6、DNMT1單一指標檢測（Z分別為4.429、4.327、1.879，均P＜0.01），見表5、圖1。

Tab.5 Diagnostic value of 24 h UAER,IL-6 and DNMT1 in diagnosing DKD表5 24 h UAER、IL-6、DNMT1對診斷DKD的診斷價值

Fig.1 ROC curve analysis of 24 h UAER,IL-6,DNMT1 and combined detection in the diagnosis of DKD圖1 24 h UAER、IL-6、DNMT1及聯合檢測診斷DKD的ROC曲線分析

3 討論

DKD是終末期腎病最常見的原因，易合并心力衰竭、腦卒中等心腦血管疾病，甚至導致患者死亡，嚴重威脅患者生命健康［7-8］。DKD的病因及發病機制較為復雜，多認為與高血糖引起的氧化應激損傷及炎癥反應有關，活性氧及晚期糖基化產物能夠激活系膜細胞中炎癥反應，導致腎小球系膜增生和腎小球間質的纖維化，最終導致DKD的發生［9］。目前，臨床上DKD的診斷主要依賴24 h UAER，但24 h UAER的測定受到感染、發熱及心力衰竭等多種因素的影響，在DKD診斷和預測DKD疾病進展上仍存在一定的局限性。因此，尋找能夠有效診斷DKD的血清標志物，對于延緩終末期腎病的發生具有重要的臨床意義。

IL-6為白細胞介素家族中的促炎細胞因子，大多由單核細胞、巨噬細胞分泌，成纖維細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞也可分泌少量IL-6。本研究中，DKD患者血清IL-6水平明顯升高，提示IL-6可能參與DKD的發病過程。有研究顯示，腎足細胞表達IL-6受體gp130，當腎足細胞受脂多糖、高血糖損傷刺激時，能夠促進IL-6的分泌［10］。24 h UAER是臨床常用的診斷DKD的指標，24 h UAER升高通常能夠增加DKD患者心血管事件和死亡風險。本研究中DKD患者IL-6的表達與24 h UAER呈正相關，證實了IL-6的表達升高可能參與DKD的發展。有研究發現，IL-6能夠通過促進腎足細胞中Jacus相關激酶2結合gp130并發生自身磷酸化，進而誘導信號轉導與轉錄活化因子3的磷酸化激活，促進足細胞肥大及凋亡，促進DKD的進展［11］。本研究中，多因素Logistic回歸分析結果證實，IL-6升高是影響DKD發生的獨立危險因素，提示IL-6升高是參與DKD疾病發生、發展的重要血清標志物。推測其機制，IL-6作為一種促炎細胞因子，可以招募并激活中性粒細胞、單核細胞以及巨噬細胞，促進腫瘤壞死因子α等促炎細胞因子的大量釋放，導致單核細胞以及巨噬細胞對腎小球基底膜組織的浸潤，進而使機體的炎癥損傷加重，氧化應激代謝發生異常，加重了腎小球基底膜損傷［12］。

表觀遺傳學是核苷酸序列的甲基化、乙酰化等修飾引起基因表達的變化，從而參與機體炎癥、代謝等生理及病理學過程的調控，與糖尿病的發生、發展關系密切［13］。岳銳等［14］研究認為，DNA甲基化可以通過影響細胞凋亡與代謝過程，從而對腎病患者的腎功能以及腎臟纖維化產生不利影響。DNMT1是負責維持DNA復制后甲基化模式的主要酶，可將甲基轉移到基因組DNA的胞嘧啶核苷酸上，該基因的表達失常與小腦共濟失調、腫瘤發生和發展密切相關［4］。本研究結果顯示，DKD患者外周血單個核細胞中DNMT1表達明顯升高，并且其表達水平與24 h UAER呈正相關，提示DNMT1表達升高參與DKD的疾病發生、發展過程。Zhang等［15］研究顯示，DKD小鼠模型腎小球足細胞的DNMT1蛋白呈高表達，表明DNMT1促進了糖尿病腎病足細胞的炎癥性損傷，而在使用DNA甲基化抑制劑5-Aza后蛋白尿的水平明顯降低，足細胞損傷程度也有所減輕。本研究進一步證實，DNMT1升高是影響DKD發生的獨立危險因素。Chen等［16］研究發現，糖尿病患者外周血單核細胞中DNMT1的上調能夠誘導哺乳動物雷帕霉素靶蛋白啟動子區域胞嘧啶異常甲基化，引起哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路的過度激活，進而加重糖尿病腎臟組織的過度炎癥。本研究中DNMT1與IL-6表達呈顯著正相關，提示DNMT1與IL-6的表達可能存在相互作用的關系。分析其機制，一方面，IL-6能夠直接激活DNMT1的表達，進而抑制下游E-鈣黏蛋白的表達，促進細胞間質化，加重腎臟纖維化［17］；另一方面，DNMT1的表達升高能夠抑制IL-6的甲基化水平，促進IL-6的表達，參與DKD疾病的發生、發展過程［18］。本研究通過ROC分析發現，24 h UAER、DNMT1與IL-6聯合檢測診斷DKD的AUC顯著高于各單一指標檢測，提示三者聯合檢測是診斷DKD的良好指標，可作為后續臨床診斷的可行參考。

綜上所述，IL-6、DNMT1在DKD患者中表達上調，與DKD患者的病情發展情況密切相關。較高水平的24 h UAER、IL-6、DNMT1是影響DKD發生的獨立危險因素，24 h UAER、DNMT1、IL-6聯合檢測可作為DKD臨床診斷的預測指標。然而，本研究納入的樣本量相對較少，未對可能參與DKD患者病情發展的其他炎癥因子如腫瘤壞死因子α、IL-1β等進行研究，有待今后進一步擴大樣本量，并對其他可能參與DKD疾病發生、發展的其他炎癥因子進行探索。