CTD-ILD患者血清YKL-40和CCL18水平的變化及意義

王冬梅，袁寶軍，高利常，袁偉

結(jié)締組織病（connective tissue disease，CTD）是以結(jié)締組織和血管慢性炎癥為病理基礎(chǔ)的一組自身免疫性疾病，其并發(fā)癥較多，當(dāng)CTD患者肺部受累時(shí)常表現(xiàn)為間質(zhì)性肺疾病（interstitial lung disease，ILD）［1］。結(jié)締組織病相關(guān)間質(zhì)性肺疾病（CTD-ILD）起病隱匿，主要依據(jù)臨床表現(xiàn)及肺部高分辨CT（HRCT）診斷，患者就診時(shí)多屬中晚期，已錯(cuò)過(guò)了最佳的治療時(shí)機(jī)，病死率高。因此，尋找早期特異性血清標(biāo)志物對(duì)于早發(fā)現(xiàn)、早診斷和治療CTD-ILD具有重要的臨床意義。甲殼質(zhì)酶蛋白40（chitinase protein 40，YKL-40）是一種分泌型糖蛋白，具有參與炎癥、細(xì)胞增殖和組織重塑的多效生物活性，已被證實(shí)可用于評(píng)估多種自身免疫疾病的活動(dòng)性與嚴(yán)重程度［2-3］。而趨化因子配體18（chemokine ligand 18，CCL18）為CC族趨化因子，在機(jī)體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［4］。近幾年國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道，YKL-40可能參與肺纖維化過(guò)程［5-6］，特發(fā)性肺纖維化患者血清中CCL18水平與肺纖維化程度相關(guān)［7］。本研究通過(guò)分析CTD-ILD患者血清中YKL-40和CCL18水平變化情況，探討其在CTD-ILD患者診斷及病情嚴(yán)重程度評(píng)估中的應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 以2018年3月—2019年8月開(kāi)灤總醫(yī)院住院確診的105例CTD患者為研究對(duì)象，其中男21例，女84例，年齡20~79歲，平均（55.21±1.67）歲，病程2個(gè)月~21年。其中系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）29例，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）24例，混合性結(jié)締組織疾病（MCTD）20例，系統(tǒng)性硬皮癥（SSc）10例，原發(fā)性干燥綜合征（SS）12例，系統(tǒng)性血管炎（SV）6例，多發(fā)性肌炎/皮肌炎（PM/DM）4例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有患者入院3 d內(nèi)進(jìn)行肺部HRCT檢查。（2）SLE符合2009年系統(tǒng)性狼瘡國(guó)際協(xié)作組（SLICC）修訂的由美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)；RA符合2010年ACR/歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（EULAR）制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)；MCTD符合1987年Gordon Sharp診斷標(biāo)準(zhǔn)；SSc符合2013年ACR/EULAR制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)；SS符合2002年原發(fā)性干燥綜合征國(guó)際（分類(lèi)）診斷標(biāo)準(zhǔn)；SV符合1994年Chapel Hill分類(lèi)診斷標(biāo)準(zhǔn)；PM/DM符合1975年Bohan/Peter提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)。（3）符合CTD-ILD診斷標(biāo)準(zhǔn)。確診為CTD，同時(shí)符合以下2項(xiàng)或2項(xiàng)以上指征，即出現(xiàn)咳嗽、氣短、胸痛、呼吸困難等典型的呼吸道癥狀，肺功能檢測(cè)通氣障礙或彌散性功能不全，HRCT檢查出現(xiàn)1項(xiàng)以上間質(zhì)性肺炎的影像學(xué)改變，肺部活檢表現(xiàn)為間質(zhì)性病變，無(wú)感染依據(jù)且抗感染治療5~7 d后無(wú)效。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）放射性肺炎、過(guò)敏性肺炎、藥物性肺炎、特發(fā)性肺纖維化、硅沉著病、石棉沉著病導(dǎo)致的間質(zhì)性肺疾病。（2）合并冠狀動(dòng)脈血管性疾病以及腎臟透析的患者。（3）存在腦血管、消化、內(nèi)分泌及造血系統(tǒng)等原發(fā)疾病的患者。

根據(jù)患者臨床癥狀及肺部HRCT檢查結(jié)果，37例患者出現(xiàn)ILD（CTD-ILD組），其中男8例，女29例，年齡32~75歲，平均（56.51±10.93）歲，病程8個(gè)月~20年。另68例未合并ILD的CTD患者（CTD組），同時(shí)選擇年齡、性別匹配的35例健康體檢者作為對(duì)照組。3組受試對(duì)象一般臨床資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，見(jiàn)表1、2。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)：2020040），患者均簽署知情同意書(shū)。

Tab.1 Analysis of general information in the studied people表1 研究對(duì)象的一般資料分析

Tab.2 Comparison of primary disease classification between the CTD-ILD group and the CTD group表2 CTD-ILD組與CTD組原發(fā)病分類(lèi)比較［例（%）］

1.2 方法

1.2.1 資料收集 詳細(xì)記錄研究對(duì)象的性別、年齡、病程、是否吸煙、是否使用激素、免疫抑制劑使用情況等臨床資料，并記錄白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、血紅蛋白（Hb）、血小板（PLT）、血沉（ESR）、C反應(yīng)蛋白（CRP）、免疫球蛋白（Ig）A、IgG、IgM、補(bǔ)體C3、癌胚抗原（CEA）等實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果及肺部HRCT影像學(xué)表現(xiàn)。

1.2.2 血清YKL-40和CCL18檢測(cè) 所有研究對(duì)象均清晨空腹采集靜脈血3 mL，室溫靜置1 h后，3 000 r/min（離心半徑17.5 cm）低溫離心10 min，提取血清放入EP管中后，置-20℃冰箱保存，待統(tǒng)一測(cè)定。檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）進(jìn)行檢測(cè)。所有試劑使用前均平衡至室溫，測(cè)定嚴(yán)格按各操作說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。所用儀器為瑞士Tecan公司生產(chǎn)的sunrise型號(hào)酶標(biāo)儀，測(cè)定結(jié)果依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的光密度（OD）值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到直線(xiàn)回歸方程，再依據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。

1.2.3 肺部HRCT評(píng)分 采用美國(guó)GE公司Revolution 256排螺旋CT設(shè)備對(duì)CTD-ILD患者進(jìn)行肺部掃描。按Müller評(píng)分法［8］進(jìn)行肺部HRCT評(píng)分：選擇主動(dòng)脈弓、氣管分叉和膈頂上方1 cm共3個(gè)層面，按照磨玻璃影改變、網(wǎng)格影改變和蜂窩影的改變程度記分；無(wú)改變，0分；病變范圍≤5%，1分；病變范圍6%~24%，2分；病變范圍25%~49%，3分；病變范圍50%~75%，4分；病變范圍＞75%，5分；將3種改變?cè)u(píng)分累加后計(jì)算總分。由放射科2位副主任及以上級(jí)別的醫(yī)師進(jìn)行HRCT評(píng)分并取其平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)；偏態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)［M（P25，P75）］表示，2組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，組間多重比較通過(guò)Bonferroni法校正檢驗(yàn)水準(zhǔn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；各指標(biāo)的診斷性能采用受試者工作特征（ROC）曲線(xiàn)分析，危險(xiǎn)因素分析采用多因素Logistic回歸，相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組研究對(duì)象血清中YKL-40和CCL18水平比較 CTD-ILD組血清中YKL-40和CCL18水平明顯高于CTD組和對(duì)照組，CTD組血清中YKL-40水平明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而CTD組血清中CCL18水平與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

2.2 CTD-ILD組和CTD組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 CTDILD組血清CEA水平明顯高于CTD組（P＜0.01），其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表4。

2.3 CTD患者發(fā)生ILD的危險(xiǎn)因素分析 以ILD是否發(fā)生作為因變量（發(fā)生ILD=1，未發(fā)生ILD=0），將YKL-40、CCL18、CEA作為自變量，多因素Logistic回歸分析顯示，YKL-40和CCL18升高是CTD患者發(fā)生ILD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），見(jiàn)表5。

Tab.3 Comparison of serum YKL-40 and CCL18 levels between the three groups表3 3組研究對(duì)象血清中YKL-40和CCL18水平比較［ng/L，M（P25，P75）］

Tab.4 Comparison of clinical laboratory indicators between the CTD-ILD group and the CTD group表4 CTD-ILD組與CTD組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

Tab.5 Multivariate Logistic regression analysis of ILD in CTD patients表5 CTD患者發(fā)生ILD的多因素Logistic回歸分析

2.4 血清YKL-40、CCL18水平對(duì)CTD-ILD的診斷價(jià)值 ROC曲線(xiàn)分析結(jié)果顯示，血清YKL-40水平對(duì)CTD-ILD有診斷價(jià)值（P＜0.05），最佳截?cái)嘀禐? 484.6 ng/L；血清CCL18水平對(duì)CTD-ILD診斷價(jià)值有限（P＞0.05）；YKL-40聯(lián)合CCL18對(duì)CTD-ILD有診斷價(jià)值（P＜0.05），且聯(lián)合診斷的敏感度高于YKL-40與CCL18單獨(dú)診斷，見(jiàn)圖1、表6。

Fig.1 ROC curve of serum YKL-40 and CCL18 levels in the diagnosis of CTD-ILD圖1 血清YKL-40和CCL18對(duì)CTD-ILD診斷價(jià)值的ROC曲線(xiàn)

Tab.6 ROC curve analysis results of serum YKL-40 and CCL18 levels in the diagnosis of CTD-ILD表6血清YKL-40和CCL18水平對(duì)CTD-ILD診斷價(jià)值的ROC曲線(xiàn)分析結(jié)果

2.5 血清YKL-40、CCL18水平與肺部影像學(xué)改變的相關(guān)分析 CTD-ILD患者的肺部HRCT評(píng)分平均為（2.68±0.37）分。CTD-ILD患者血清中YKL-40、CCL18水平與肺部HRCT評(píng)分均呈正相關(guān)（rs分別為0.697、0.472，均P＜0.05）。

3 討論

ILD是一組以肺泡炎癥和間質(zhì)纖維化為基本病變的彌漫性肺疾病，其病因多樣，包括環(huán)境因素、職業(yè)、藥物、免疫反應(yīng)等。其中CTD是通過(guò)自身免疫反應(yīng)引起ILD的主要病因之一［9］。有學(xué)者認(rèn)為，由于CTD患者免疫系統(tǒng)紊亂導(dǎo)致巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞活化，從而釋放多種細(xì)胞因子，造成肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間基底膜的損傷、異常纖維母細(xì)胞增生、炎癥及細(xì)胞外基質(zhì)成分的沉積等［10］。目前臨床上對(duì)CTD-ILD的診斷主要依靠其臨床特征、肺部HRCT及組織病理學(xué)檢查，但這不利于疾病的早期診斷，且費(fèi)用較高。因此，尋找相對(duì)特異和敏感的生物標(biāo)志物是早期診斷、優(yōu)化治療及改善CTD-ILD患者預(yù)后的關(guān)鍵。

YKL-40是由活化的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌的炎性糖蛋白，具有調(diào)節(jié)炎癥的作用，屬于幾丁質(zhì)酶成員，分子質(zhì)量為40 ku，因其N(xiāo)端起始氨基酸為酪氨酸（Y）、賴(lài)氨酸（K）和亮氨酸（L），故被稱(chēng)為YKL-40，可作為急慢性炎癥相關(guān)標(biāo)志物，在氣管重塑和組織纖維化中發(fā)揮重要作用［11］。近年來(lái)，YKL-40被認(rèn)為是診斷ILD和判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物，尤其是特發(fā)性肺纖維化和結(jié)節(jié)病［12-13］。有研究發(fā)現(xiàn)，PM/DM-ILD患者血清YKL-40水平顯著高于健康對(duì)照，表現(xiàn)為YKL-40在PM/DM-ILD患者聚集的肺泡內(nèi)巨噬細(xì)胞和過(guò)度增殖的肺泡上皮細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)，血清高水平Y(jié)KL-40是患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［14］。SSc合并ILD患者血清中YKL-40水平也較正常對(duì)照組升高［15］。本研究結(jié)果顯示，CTD-ILD組血清中YKL-40水平明顯高于CTD組和對(duì)照組，提示YKL-40作為結(jié)締組織的細(xì)胞生長(zhǎng)因子與多種自身免疫性疾病的活動(dòng)性或嚴(yán)重程度有關(guān)，且其作為機(jī)體炎癥反應(yīng)因子可能參與CTD-ILD患者的肺部炎癥、組織重塑或纖維化過(guò)程，與相關(guān)研究報(bào)道基本一致［16-17］。

CCL18又稱(chēng)肺活化調(diào)節(jié)趨化因子，屬CC族趨化因子，主要由肺組織中的樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)，由Th2型細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素（IL）-4、IL-10和IL-13等激活，在炎癥刺激時(shí)表達(dá)明顯升高。CCL18可誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞膠原合成，進(jìn)而導(dǎo)致肺纖維化和肺功能的下降［18］。Kodera等［19］比較了SSc-ILD患者中血清CCL18水平，發(fā)現(xiàn)SSc-ILD患者血清CCL18水平升高，且與一氧化碳彌散量（DLCO）和用力肺活量（FVC）呈負(fù)相關(guān)。Hoffmann-Vold等［20］通過(guò)一項(xiàng)前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，SSc-ILD患者的血清中CCL18血清水平越高，肺纖維化進(jìn)展越重，可以作為預(yù)測(cè)SSc-ILD疾病進(jìn)展的生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，CTD-ILD組血清中CCL18水平明顯高于CTD組和對(duì)照組，提示CTD-ILD組患者中肺泡巨噬細(xì)胞激活，CCL18產(chǎn)生增加，血清中CCL18明顯升高，可能與患者的肺纖維化重塑有關(guān)，與Cai等［21］的研究報(bào)道基本一致。此外，本研究結(jié)果還顯示，與對(duì)照組比較，CTD組患者血清中YKL-40水平明顯增高，而CCL18水平有增高趨勢(shì)但不顯著，推測(cè)YKL-40和CCL18可能對(duì)CTD患者發(fā)生ILD的早期篩查有一定意義。

本研究通過(guò)多因素Logistic回歸分析顯示，血清YKL-40和CCL18升高是CTD患者發(fā)生ILD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；ROC曲線(xiàn)分析結(jié)果顯示，血清YKL-40水平對(duì)CTD-ILD有診斷價(jià)值，而CCL18血清水平對(duì)CTD-ILD診斷價(jià)值有限，YKL-40聯(lián)合CCL18診斷CTD-ILD的價(jià)值高于YKL-40和CCL18單獨(dú)診斷。因此，血清YKL-40有望成為診斷CTD-ILD的血清標(biāo)志物，且YKL-40和CCL18聯(lián)合檢測(cè)更有助于CTD-ILD患者的早期診斷。賀新偉等［22］研究發(fā)現(xiàn)，CTD-ILD患者肺泡灌洗液中CCL18水平升高，可能與肺部病變嚴(yán)重程度及住院期間預(yù)后相關(guān)，CCL18是潛在的CTD-ILD疾病嚴(yán)重性及預(yù)后的標(biāo)志物。本研究顯示，CTD-ILD患者血清YKL-40、CCL18水平與肺部HRCT評(píng)分均呈正相關(guān)，提示CTD-ILD患者血清中YKL-40和CCL18水平可能隨著肺部組織病變加重而增加，檢測(cè)血清YKL-40和CCL18水平有助于患者的病情評(píng)估。

綜上所述，CTD-ILD患者血清中YKL-40和CCL18水平顯著升高，兩者均是CTD患者發(fā)生ILD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可作為簡(jiǎn)單易行且可重復(fù)檢測(cè)的血清標(biāo)志物；兩者聯(lián)合檢測(cè)有助于CTD-ILD早期診斷及病情評(píng)估。由于本次研究對(duì)象均為住院患者，以CTD急性加重與CTD-ILD加重原因入院，YKL-40和CCL18在疾病穩(wěn)定期是否也存在相同變化，還需要今后繼續(xù)探究。