代謝組學(xué)在小于胎齡兒發(fā)病機制研究中的應(yīng)用

楊 弋,朱 軍,李小洪

小于胎齡兒(small for gestational age, SGA)指出生體重和(或)身長低于同性別同胎齡第10個百分位以下的嬰兒[1],是常見的產(chǎn)科并發(fā)癥;亦稱胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩(intrauterine growth retardation, IUGR)。IUGR是小于胎齡兒(small for gestational age infant,SGA)的宮內(nèi)階段,由于IUGR在子宮內(nèi)的識別困難,因此很多文獻(xiàn)中兩者無明顯區(qū)分,二者的結(jié)果常常相互替代。2005年中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會對國內(nèi)22個省(區(qū)、市)的 86 所醫(yī)院調(diào)查顯示:我國SGA發(fā)生率為6.61%[2]。2010年《柳葉刀》雜志發(fā)布的一項全球薈萃分析顯示,在138個低-中收入國家SGA發(fā)生率高達(dá)27%,在SGA出生數(shù)量前10位的國家中,中國居全球第五[3]。SGA往往合并諸多健康問題以及不良圍產(chǎn)結(jié)局,如胎兒宮內(nèi)窘迫、新生兒窒息、新生兒重癥監(jiān)護室治療的發(fā)生率和死亡率均高于適于胎齡兒(appropriateforgestationalage,AGA)[4]。SGA還會增加神經(jīng)功能受損以及心血管風(fēng)險[5]。從疾病預(yù)后看,SGA 也是生長遲緩、神經(jīng)心理發(fā)育障礙及成年期代謝綜合征的高危人群[6]。可見SGA是一個全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。

有學(xué)者指出[7],如能早期識別和預(yù)警SGA 的發(fā)生,早期參與高危孕母及胎兒管理,可有效降低SGA發(fā)生風(fēng)險,改善其預(yù)后結(jié)局。然而SGA發(fā)病機制尚未闡明,約40%的SGA未找到明確的病理因素[8]。SGA的發(fā)生與多種因素有關(guān),包括母親因素、胎兒因素、胎盤臍帶因素、環(huán)境因素等[9]。盡管已經(jīng)有大量關(guān)于足月SGA的危險因素研究,但仍然缺乏有關(guān)母體遺傳與環(huán)境因素對SGA影響的研究,且母體因素在SGA發(fā)生發(fā)展中的機制未明。因此需要更多新的研究來了解SGA的病因機制[10],以便精準(zhǔn)構(gòu)建SGA的檢測方法,建立基于生物標(biāo)志物的SGA預(yù)測模型。近年來“精準(zhǔn)醫(yī)療”概念的提出,有利于實現(xiàn)對疾病和患者進行個性化的精準(zhǔn)治療。其本質(zhì)是通過基因組、蛋白質(zhì)組與代謝組等先進醫(yī)療技術(shù),對大樣本人群和特定疾病類型進行生物標(biāo)志物的分析、驗證與應(yīng)用。其中代謝組學(xué)作為一種高通量、高靈敏度的精準(zhǔn)檢測技術(shù),廣泛應(yīng)用于疾病潛在病理生理機制的研究中?，F(xiàn)就代謝組學(xué)在小于胎齡兒發(fā)病機制中的應(yīng)用現(xiàn)狀予以綜述。

1 代謝組學(xué)研究概述

1.1 代謝組學(xué)的概念代謝組學(xué)一詞來源于代謝組。代謝組是指某一生物或細(xì)胞、組織在一特定生理時期內(nèi)所有的低分子量代謝產(chǎn)物的集合,主要是指分子量小于1000 Da的內(nèi)源性小分子[11]。代謝產(chǎn)物是基因和蛋白調(diào)控的下游產(chǎn)物也是最終產(chǎn)物,主要是一些參與生物體新陳代謝、維持生物體正常功能和生長發(fā)育的小分子化合物。代謝組學(xué)技術(shù)是后基因時代發(fā)展起來的系統(tǒng)生物學(xué)檢測新技術(shù),以生物體內(nèi)所有代謝產(chǎn)物為研究對象,其主要目標(biāo)是定性定量研究代謝物與機體生理病理變化之間的關(guān)系,從整體水平揭示疾病的發(fā)病機制。代謝組檢測的是基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組的可變性下游表型,從而可以提供高度整合的生物學(xué)狀態(tài)概況;同時放大了基因和蛋白表達(dá)的微小變化,從而使檢測更容易[12]。因此,代謝組學(xué)的變化可以直接或間接反映外界刺激或遺傳修飾對生物體代謝應(yīng)答的改變,將遺傳、環(huán)境和生理因素與特定的病理狀態(tài)聯(lián)系起來,已經(jīng)在疾病的診斷、分型和生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮重要作用。

1.2 代謝組學(xué)的研究方法目前常用的代謝組學(xué)檢測技術(shù)主要有核磁共振 (nuclear magnetic reso-nance spectroscopy,NMR 、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 (gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS) 或液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS) 。NMR幾乎不需要樣品預(yù)處理,檢測速度快,不破壞樣品,但其靈敏度低和分辨率差,可能會導(dǎo)致信號重疊,低豐度代謝物被高豐度代謝物所掩蓋[13]。GC-MS 具有較高的分辨率和檢測靈敏度,缺點是樣品前處理工作量大且難以進行新的化合物鑒定[11]。LC-MS具有更高的靈敏度和較廣的檢測范圍,可用于分析相對分子質(zhì)量較高且熱穩(wěn)定性較差的化合物。因此,其更適合用于樣品中復(fù)雜代謝物的檢測[14]。

代謝組學(xué)研究主要有兩種策略,包括非靶向和靶向分析。研究人員既可采用針對特定代謝物的靶向分析,也可采用非靶向分析來檢測盡可能多的代謝物類別,包括代謝數(shù)據(jù)庫中標(biāo)注的未知代謝物。非靶向代謝組學(xué)具有較好的代謝物檢測覆蓋率,但對低豐度代謝物質(zhì)的檢測重現(xiàn)性較差,且靈敏度低,同時需要對樣品進行分離,對樣品具有破壞性。而靶向代謝組學(xué)具有靈敏度高、動態(tài)檢測范圍廣以及定量結(jié)果準(zhǔn)確率高等特點,被視為代謝物定量分析的金標(biāo)準(zhǔn)[12]。雖然以上技術(shù)均能同時定量樣本中共存的多種代謝物,但仍不能覆蓋整個代謝組,只有多個分析平臺聯(lián)合應(yīng)用,才能提高代謝組學(xué)研究的覆蓋率。

2 代謝組學(xué)在SGA中的應(yīng)用

目前,母親的血液、尿液和頭發(fā)已被用于代謝組學(xué)分析,也有研究采用羊水、臍帶靜脈血和新生兒尿液等進行胎兒發(fā)育遲緩評估。代謝組學(xué)方法已經(jīng)確定了可能導(dǎo)致FGR或者SGA的幾種途徑和代謝過程,如DNA甲基化的破壞[15]、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[16, 17]、神經(jīng)遞質(zhì)前體[17, 18]和能量產(chǎn)生[16, 17]。

2.1 頭發(fā)代謝組學(xué)一項對母親頭發(fā)[10, 17, 19]的非靶向分析提供了可靠的預(yù)測精度,表明應(yīng)該在不同的情景下進行驗證。分娩時,多普勒異常的孕婦母親/新生兒中鏈脂肪酸比例下調(diào),表明新生兒對能量和結(jié)構(gòu)代謝物的需求增加[20]。Thibaut[21]等采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(Gas chromatography- mass spectrometry,GC-MS)對83名新加坡孕婦的頭發(fā)樣本進行代謝物測定,發(fā)現(xiàn)頭發(fā)代謝物在妊娠過程中發(fā)生改變,并可反映氨基酸、三羧酸循環(huán)中間體、脂肪酸、輔助因子、維生素相關(guān)代謝物和外源性藥物水平的變化。

2.2 血清代謝組學(xué)有研究表明,胎兒的生長在很大程度上取決于母體血流中營養(yǎng)物質(zhì)的可獲得性以及胎盤中營養(yǎng)特異性轉(zhuǎn)運蛋白的活性[20]。在妊娠晚期,在胎兒組織和大腦中有大量的脂肪沉積,因此產(chǎn)生了對母體脂肪酸代謝的一些研究,并且指出在SGA妊娠的母體中存在著脂質(zhì)代謝紊亂[22]。研究發(fā)現(xiàn),大多數(shù)長鏈脂肪酸(Long chain fatty acids,LCFAs)的含量在母體血和臍帶血之間是不同的[23],LCFAs與IUGR或SGA之間存在相關(guān)性。在母體和胎兒血漿中檢測到的最豐富的脂肪酸是C16∶0和C18∶0,其次是相對不飽和的形式(C16∶1, C18∶1, C18∶2)[24, 25]。Bobiński等[26]比較了足月、早產(chǎn)和SGA新生兒的母親和臍血的脂肪酸譜,發(fā)現(xiàn)了早產(chǎn)兒和SGA新生兒月桂酸成分的變化。早產(chǎn)婦女的飲食結(jié)構(gòu)中短鏈和中鏈脂肪酸水平較低。結(jié)果顯示臍帶血C12∶0水平高于AGA組,在臍帶血中C12∶0的百分比和母體中中鏈脂肪(Medium chain fatty acids,MCFAs)的估計攝入量之間存在反比。表明胎盤在補償過程中發(fā)揮重要作用,對母親飲食組成的變化敏感,通過調(diào)節(jié)胎兒脂肪酸水平,以防止胎兒缺乏。即在SGA母體中,MCFAs從頭合成增加,并且很容易通過擴散轉(zhuǎn)運到胎兒。因此,MCFAs水平可能是妊娠期SGA早期診斷的一個指標(biāo)。Miranda等[27]使用孕婦和臍帶血血漿樣本進行基于NMR的代謝指紋打印和擴增,發(fā)現(xiàn)磷脂酰膽堿和糖蛋白在生長受限胎兒中有顯著變化。生長受限胎兒母親的IDL、甘油三酯-IDL和高密度脂蛋白(HDL)差異有統(tǒng)計學(xué)意義,揭示了SGA母親的脂質(zhì)代謝物顯著減少,表明母親對妊娠的代謝適應(yīng)失敗。Favretto等[28]對宮內(nèi)生長受限進行了另一項代謝組學(xué)研究。臍帶血的 LC-MS分析顯示苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸水平升高。對宮內(nèi)生長受限的代謝組學(xué)研究推動了產(chǎn)前和產(chǎn)后檢測新診斷標(biāo)準(zhǔn)的出現(xiàn)[29]。大多數(shù)鑒別代謝物與三羧酸循環(huán)有關(guān),包括檸檬酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、亮氨酸。故通過對這些有意義的代謝物進行定量分析,即可列出新的評估標(biāo)準(zhǔn)。而Ivorra等[30]報道了FGR胎兒臍血中五種氨基酸濃度的顯著差異(脯氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸降低,而苯丙氨酸和瓜氨酸增加)。Bernard等[31]研究發(fā)現(xiàn),亞油酸水平與體重和腹部脂肪組織體積呈正相關(guān),而二十二碳六烯酸與生長的比例(長度/高度)相關(guān)。2010年,Horgan和他的同事們研究了來自生下健康單胎胎兒的婦女和疑似患有SGA(出生體重低于孕齡10%)的婦女的臍帶血。在此分析的同時,對懷孕15周的婦女進行了血漿樣本分析[16]。他們采用超高效液相檢測代謝組學(xué)色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS)在三個獨立的研究中進行驗證,研究結(jié)果顯示,29種代謝物在對照組之間的濃度差異很大(足以滿足胎齡和SGA)。其中19種代謝物被確定為模型的預(yù)測因子,并應(yīng)用于臍帶血和母體外周血的分析。在后一種情況下,預(yù)測模型的曲線下面積(AUC)為0.9,這代表了癥狀前SGA的穩(wěn)健預(yù)測模型。同時在SGA發(fā)病前的妊娠早期血漿中也發(fā)現(xiàn)了一致的特異性代謝物特征,對SGA疾病發(fā)病機制的深入了解提供了途徑。Liu等[32]對宮內(nèi)生長受限新生兒氨基酸變化提出可能機制:第一,氨基酸的利用率可能會降低[32]。宮內(nèi)生長受限改變了蛋白表達(dá)譜,導(dǎo)致氨基酸利用率降低,進而增加了體內(nèi)氨基酸濃度。第二,可能存在母體機制可以補償胎兒的氨基酸代謝。既往研究表明孕有宮內(nèi)生長受限胎兒的母親體內(nèi)氨基酸濃度高于孕有適于胎齡胎兒的母親,并且大多數(shù)氨基酸通過胎盤從母體轉(zhuǎn)運到胎兒,引起胎兒或新生兒體內(nèi)氨基酸濃度的增加。第三,胎盤中氨基酸轉(zhuǎn)運體可能具有代償功能。胎盤有多個氨基酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng),它可以同時運輸一種或一族氨基酸,同樣的氨基酸可以通過多種轉(zhuǎn)運體運輸。體重低于第 3 百分位的宮內(nèi)生長受限新生兒出現(xiàn)明顯的氨基酸濃度下降,可能與胎盤氨基酸轉(zhuǎn)運體功能受損有關(guān)。隨著出生體重的增加,氨基酸和?；鈮A呈代償性增加或減少,當(dāng)出生體重達(dá)到第10百分位時,IUGR新生兒與AGA新生兒相似。Bahado-Singh等[21]首次采用質(zhì)子核磁共振(H-NMR)和直接注射-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(direct injection coupled with liquid chromatography tandem MS,DI-LS-MS)相結(jié)合的技術(shù)來檢測宮內(nèi)生長發(fā)育遲緩的生物標(biāo)記物。他們采用臍血,利用人工智能和多平臺代謝組學(xué)分析(核磁共振和質(zhì)譜)對胎兒宮內(nèi)生長受限進行了預(yù)測,發(fā)現(xiàn)了相關(guān)的代謝途徑,如肝功代謝和能量代謝。

2.3 尿液代謝組學(xué)Dessi等[33]研究了FGR新生兒的尿液代謝特征,并將其與對照組進行比較,報告了宮內(nèi)生長受限嬰兒在三個生化途徑上的代謝受損。這些途徑包括精氨酸和脯氨酸代謝、尿素循環(huán)、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝。鑒別代謝產(chǎn)物為肌醇[34]、肌氨酸、肌酸和肌酐。在高分解代謝狀態(tài)下,尿液中這些代謝物的增加被觀察到,就像在禁食的情況下,有一個較低水平的蛋白質(zhì)合成[18]。血漿和尿液中肌醇含量的增加似乎與成人葡萄糖耐受不良和胰島素抵抗有關(guān),因此可能成為胎兒發(fā)育過程中的一個有效指標(biāo)。另一方面,Maitre等[35]采用質(zhì)子核磁共振(proton nuclear magnetic resonance,H-NMR)技術(shù)通過測量妊娠早期的尿代謝物,發(fā)現(xiàn)尿代謝譜與不良出生結(jié)局風(fēng)險增加相關(guān),強調(diào)了尿代謝組學(xué)研究作為一種新型無創(chuàng)生物標(biāo)志物在識別早產(chǎn)和SGA風(fēng)險中的潛力,他們發(fā)現(xiàn)在妊娠晚期前三個月的孕婦尿液樣本中,酪氨酸、醋酸鹽、三甲胺和甲酸鹽的含量有所下降。這些分子可以在碳水化合物和脂肪代謝中發(fā)揮作用(醋酸鹽),作為神經(jīng)遞質(zhì)的前體(酪氨酸),作為活性氧水平提高導(dǎo)致細(xì)胞死亡的介質(zhì)(甲酸鹽),或者只是蔬菜攝入的標(biāo)記物(三甲胺)。這些發(fā)現(xiàn)突出了FGR發(fā)病機制的復(fù)雜性,并提供了一些線索。

3 動物模型

Selak等[36]通過孕鼠半饑餓法造成SGA的動物模型實驗發(fā)現(xiàn),SGA仔鼠在成年后會出現(xiàn)胰島素敏感性降低,糖耐受不良。通過鉗夾子宮動脈引起胎盤缺血缺氧、胎兒營養(yǎng)不良產(chǎn)生小鼠SGA,小鼠自幼年時就表現(xiàn)為血糖異常,成年后表現(xiàn)出明顯糖尿病癥狀,特點是空腹血糖升高和高胰島素血征。Chen等[37]研究發(fā)現(xiàn)通過孕期酒精造成的SGA鼠模型,血漿和肝臟中甘油三酯水平均升高,脂聯(lián)素和抵抗素水平升高通過抑制β腎上腺素能受體激動劑,cAMP活化劑和腫瘤壞死因子α從而導(dǎo)致胰島素抵抗。Boloker等[38]通過正常血糖-高胰島素鉗夾技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)SGA鼠自出生1周起胰島素敏感性開始降低且不斷惡化。肝臟和肝外組織對胰島素的敏感性降低,骨骼肌對外周血糖的攝取率明顯降低。三種經(jīng)典的SGA動物模型都可以證實SGA鼠的胰島素敏感性受損,成年后可發(fā)展為糖尿病。

4 代謝組學(xué)在SGA相關(guān)研究中存在問題及展望

通過以上研究發(fā)現(xiàn),大部分SGA的代謝組學(xué)研究結(jié)果,其生物標(biāo)志物都集中在脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝、肝臟代謝及能量代謝途徑。但目前有關(guān)小于胎齡兒與孕期代謝的研究仍然存在以下問題:①研究設(shè)計缺陷:多為單個孕期的橫斷面研究,缺乏整個孕期多時段的動態(tài)分析。而胎兒生長發(fā)育是個動態(tài)的過程,要研究SGA的發(fā)病機制需要從動態(tài)的角度綜合考慮,不能局限于某一單次隨機樣本。②結(jié)局指標(biāo)未細(xì)化:未對SGA進行不同分界點的對比研究,比如未將體質(zhì)量小于第三百分位(重度)和小于第十百分位(輕度)的SGA進行比較[39],分析輕重度SGA母體代謝是否存在差異,因為重度SGA胎兒預(yù)后更差,更應(yīng)該盡早識別并進行干預(yù),提高存活率和生存質(zhì)量;③代謝組學(xué)檢測方法缺陷:多為非靶向代謝組學(xué)檢測,采用的是數(shù)據(jù)依賴性采集技術(shù)(data-dependent acquisition,DDA),DDA的檢測具有隨機性,定量不準(zhǔn)確。而廣泛靶向是一種整合了非靶向和靶向代謝物檢測技術(shù)優(yōu)點的新型代謝組檢測技術(shù),采用不同的LC-MS/MS檢測平臺和多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)技術(shù)進行精準(zhǔn)定量,實現(xiàn)了高通量、高靈敏、廣覆蓋的靶向代謝物檢測,目前應(yīng)用較少,可在未來推廣使用。④計分析方法單一:多采用代謝組學(xué)常規(guī)分析方法及回歸分析,當(dāng)病例較少時可能存在高維困擾及共線性問題,對于大量數(shù)據(jù)的分析精確度有待提高;而機器學(xué)習(xí)的應(yīng)用可以最大限度的提高統(tǒng)計效能,精準(zhǔn)獲取差異性。

綜上,后續(xù)有關(guān)SGA的孕期代謝研究可采用廣泛靶向代謝組學(xué)的方法進行動態(tài)預(yù)測,探索不同孕期血尿代謝譜的動態(tài)變化,并利用機器學(xué)習(xí)方法識別對于足月SGA有臨床價值的代謝標(biāo)志物,為足月SGA發(fā)生機制的闡釋和早期預(yù)測提供新的方向及策略。