腸道微生態在類風濕關節炎發病機制中的意義

鐘 雪,劉 焱,郭紅梅,龍 麗

腸道微生態在維持健康和患病狀況方面起著至關重要的作用。各種器官和系統,都受到腸道微生物群的影響。已有研究發現,腸道微生態參與調控人體黏膜免疫,其產生的短鏈脂肪酸誘導調節性T細胞的產生,在維持免疫穩態中起到關鍵作用[1],此外,其尚可參與許多藥物的代謝過程[2],影響對免疫治療的應答[3]等。包括類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)在內的多種自身免疫性疾病均受到腸道微生態的影響[4]。本文就近年來的文獻報道中,關于腸道微生態在RA中的研究作一綜述。

1 腸道微生態概述

人體內存在大量的微生物(細菌、真菌、古細菌等),其中腸道是人體微生物含量最多的器官,主要成分是細菌,超過1000個細菌屬定植于人體腸道[5]。人體腸道中的大多數細菌屬于四個門,厚壁菌門,擬桿菌門,變形桿菌門和放線菌門。胃腸道中細菌的基因組含量(亞基因組)是人類的150倍左右[6],這些微生物共同形成了腸道微生態。由于腸道微生態的存在及紊亂可以影響機體的免疫功能,腸道現在被認為是一個重要的免疫器官,腸道微生態對宿主免疫系統的發育和功能有著深遠的影響。

首先,在維持生理機能方面,組織學上,腸上皮細胞通過緊密連接,形成多功能細胞復合物屏障,防止病原體進入,而其中的腸道菌群有助于恢復上皮細胞緊密連接的蛋白質結構。此外,腸道菌群參與腸上皮細胞中防御相關分子如熱休克蛋白等的產生,尚可與致病菌競爭并分泌抗菌肽以維持腸道穩態。其次,腸道微生態與腸道營養代謝有關,腸桿菌科分解碳水化合物產生短鏈脂肪酸,這些脂肪酸被腸上皮細胞用作能量來源。

另外,腸道微生態調節宿主的腸黏膜免疫系統。有研究表明,腸道細菌中的分節絲狀菌與產生IL-17的輔助性T細胞的分化和誘導有關,而后者參與了炎癥反應。此外梭菌屬也被認為有助于調節性T細胞的分化和誘導。之前的報道證實,腸道微生態與各種疾病有關,例如炎癥性腸病、腸易激綜合征、哮喘和包括RA等在內的多種腸外自身免疫性疾病[7]。

多種因素影響腸道微生態的組成,其中,外部因素包括地域,飲食習慣,運動,吸煙和藥物等,內部因素包括遺傳、年齡、性別、體重指數和種族等。故在不同情況下進行比較可能會導致結果不一致。為了了解疾病與腸道微生態之間的關系,最好對具有相同背景因素的研究對象中進行比較。

2 腸道微生態對RA的影響

RA是一種自身免疫性炎癥性疾病,其特征是關節破壞、全身受累以及存在多種自身抗體,尤其是抗瓜氨酸肽抗體(anticitrullinated protein antibodies, ACPA),其與關節損害的預后直接相關。RA的病因不明,通常認為其發病由遺傳、環境等多因素參與,腸道微生態是其中的重要一環。

2.1 腸道微生態對RA發病機制的影響

2.1.1腸道組織的瓜氨酸靶點 首先,從組織學上,Bennike等[8]針對RA患者和健康對照的結腸黏膜組織的蛋白組學研究中,鑒定出223種瓜氨酸肽,其中三種瓜氨酸化蛋白(瓜氨酸化波形蛋白、纖維蛋白原α和肌動蛋白)是RA獨有的,ACPA的已知靶點,這支持了結腸黏膜可能是對瓜氨酸化表位免疫耐受的潛在位點。此外,與對照組相比,這些患者的結腸組織中發現瓜氨酸化波形蛋白的豐度增加,這可能表明腸黏膜亦可能作為類風濕性關節炎發病的誘發部位,即結腸黏膜組織本身可以作為瓜氨酸蛋白免疫耐受的突破點,觸發ACPA的產生?；谀c道黏膜的組織學特征以及其與腸道菌群之間的密切聯系,有理由相信腸道微生態在類風濕性關節炎發病機制中會發揮重要作用。

2.1.2RA患者的腸道菌微生態研究 隨著測序技術的發展,近十年以來,研究者們開始應用16SrRNA和/或宏基因測序對人類腸道的菌群進行高通量的檢測,他們通過比較RA患者與健康人群腸道菌群的差異,繼后結合代謝組學、臨床指標等方式對這些差異的成因進行了進一步的探討。值得一提的是,這些研究中報告的菌群差異可能會受到RA的病程(即臨床前期、早期和確診病例)、對照組中的受試者(健康或一級親屬)及地理位置等的影響,故而難以對他們的結果進行完全標準統一的探討。

Alpizar-Rodriguez等對臨床前RA人群(APCA或類風濕因子陽性和/或存在RA相關的癥狀和體征)與其一級親屬的大便菌群進行16SrRNA測序,與對照組相比,臨床前RA組中,普氏菌屬顯著富集,提示在RA患者發病前,普氏菌屬的富集有可能在RA發展中起到作用[9]。在Rooney等的研究中,同樣應用16SrRNA測序,比較了無癥狀高危(沒有臨床滑膜炎的ACPA陽性高危個體)人群和健康對照,相對于健康對照,ACPA陽性組螺旋體科、幽門螺桿菌科、瘤胃球菌科和雙歧桿菌科豐度增高,桿菌科、巴氏桿菌科、甲烷桿菌科豐度降低。5名最終發展為RA患者的α與β多樣性與ACPA陽性組無差別[10]。

早期類風濕性關節炎受試者腸道微生物群與健康人群相比亦有所不同。在Maeda等的研究中,報告了RA患者糞便中普氏菌屬的相對豐度較健康組增高[11]。Jeong等的研究表明,早期RA患者的多樣性降低導致生態失調。健康受試者和早期RA患者從門到屬水平的各種分類群的微生物分布均存在顯著差異。擬桿菌門在早期RA患者中富集,而放線菌,包括柯林斯菌屬,在健康受試者中富集[12]。

在對其他符合關節受累的RA患者的研究中,多項研究提示了類風濕性關節炎患者與健康對照組相比存在腸道某些菌群的增加和/或減少[5,12～24]。但亦有少數研究呈現陰性結果(即RA與健康組菌群無差別)[25,26]。

2019年Chiang等使用ELISA測定血清腫瘤壞死因子TNF-α、白細胞介素IL-6和IL-17A的水平,以了解其與腸道菌群的關系,研究表明ACPA陽性RA患者的α多樣性低于健康對照。與這些細胞因子水平低的患者相比,腸桿菌科和克雷伯菌的相對豐度增加,TNF-α或IL-17A水平高的雙歧桿菌豐度較低。此外,ACPA陽性患者的布勞特氏菌屬,阿克曼菌屬和梭狀芽胞桿菌屬的比例高于ACPA陰性患者[17]。

Li等將16S高通量測序結合流式細胞術,檢測了RA患者的腸道菌群及外周血淋巴細胞亞群和細胞因子水平,研究發現,RA患者的腸道微生物組與健康對照明顯不同,異常細菌群落與淋巴細胞亞群和細胞因子水平的改變有關,這提示腸道微生態的改變可能是RA的發病機制之一[20]。

在RA患者腸道微生態研究中,一部分研究顯示差異菌群集中在普氏菌屬,即RA患者糞便中會出現普氏菌屬豐度的增加[11,13,24]。2013年,Scher等[13]通過16SrRNA測序的研究發現,與對照組相比,RA患者組更可能攜帶普氏菌。另兩項來自日本的研究[11,24]亦支持此結果。Maeda等[11]觀察到,在未接受藥物治療的早期RA患者的腸道中,存在高豐度的普氏菌屬中的P. copri。同時他們在進一步的動物實驗中發現,P. copri本身具有誘導Th17細胞相關細胞因子如IL-6和IL-23的能力,從而誘發遺傳易感小鼠關節炎的發展,普氏菌屬豐度的增加與Th17細胞介導的黏膜炎癥有關,這與在其他研究中普氏菌屬在體外可驅動Th17免疫應答的顯著能力一致[27]。

在另一項研究中,Pianta等[28]證實了P. copri與RA發病機制中的免疫相關性。他們應用串聯質譜法在RA患者的滑膜組織或外周血單核細胞(PBMC)中尋找來自P. copri的的呈遞肽(T細胞抗原提呈表位),該研究顯示,在PBMC中,鑒定出來源于P. copri 27kD蛋白(Pc-p27)的HLA-DR呈遞肽,其刺激了42%的新發RA組患者的Th1免疫反應。研究還觀察到類風濕性關節炎患者對P. copri具有不同的免疫反應性,即產生IgA或IgG抗體。前者與與Th17細胞因子和ACPA相關,后者和其與滑液中的普氏菌DNA相關。在Pianta等[29]繼后的研究中,描述了兩種來源于常見腸道細菌的蛋白,這兩種蛋白可以引起類風濕性關節炎患者的免疫反應。在50%的RA患者中,N-乙酰基葡萄糖胺-6-硫酸酯酶(GNS)和絲氨酸A(FLNA)被鑒定為產生T和B細胞應答的自身抗原,但在健康對照組或其他風濕性疾病患者中沒有。HLA-DR呈遞的GNS肽與來自普氏菌屬和擬副桿菌屬的硫酸酯酶蛋白的表位具有顯著的序列同源性,而HLA-DR呈遞的FLNA肽亦普氏菌屬的表位有同源性。這些研究表明腸道菌群特別是普氏菌的T細胞表位,可能與關節中的某些自身表位發生交叉反應。

盡管以上多項研究研究表明,RA患者中攜帶的普氏菌與RA的發病有所關聯,但也有部分研究[21,24]中并沒有觀察到普氏菌在RA患者與健康人群存在差別。另外,一項研究提示了相反的結果,RA患者腸道中普氏桿菌屬所在的擬桿菌門豐度較健康對照降低,進一步相關性研究顯示普氏菌屬等的相對豐度與CD4+T細胞計數和細胞因子水平呈正相關[23]。

一些觀點認為,普氏菌可能是有益的細菌物種,而非致病菌。目前培養出將近40種的普氏菌屬種類,大多數為從口腔分離,其中三種由腸道分離[30]。Marietta等[31]評估了普氏菌屬在關節炎敏感的HLA-DQ8小鼠模型中預防和治療關節炎的能力。該研究分離培養了2種普氏菌屬(P. histicola和P. melanogenica),并用于上述小鼠模型中,當給予P. histicola后,免疫Ⅱ型膠原的DQ8小鼠關節炎的發病率和嚴重程度顯著降低,P. histicola 通過調節免疫反應(調節樹突狀細胞和Treg細胞的產生)來抑制關節炎的發展,從而抑制Th17反應并減少炎性細胞因子(IL-2、IL-17和腫瘤壞死因子)。相比之下,施用P. melanogenica后,細胞因子水平沒有明顯變化,也沒有預防關節炎的發展。這說明調節免疫反應的能力在普氏菌菌株之間并不相同,這也可咨解釋普氏菌屬是健康人群中的共生菌,但某些菌株可能表現出致病性的一面。

除普氏菌屬外,擬桿菌、變形桿菌門以及柯林斯菌屬(放線菌門)在RA患者中的富集現象也多有報道。不過,從地域上講,擬桿菌、變形桿菌門在RA患者中的富集多見于亞洲人群的報道[5,12,18,20～23],柯林斯菌屬多見于歐美人群的報道[15,19]。與上述相反的報道也大致和地域有關,在Scher等的報道中,擬桿菌門的相對豐度是降低的[13],Jeong等的研究中,柯林斯菌屬豐度較對照組減低[12]。無論在歐美或者亞洲的研究中,均可以觀察到擬桿菌門是RA患者腸道中的的相對低豐度菌[5,13]。Chen等將RA患者及其一級親屬作為對照,糞便樣本16SrRNA測序,該研究使用人上皮細胞系和關節炎的人源化小鼠模型進一步證實了RA相關菌群的作用。結果表明,柯林斯菌屬的豐度與高水平的α-氨基己二酸和天冬酰胺以及促炎細胞因子IL-17A的產生密切相關。柯林斯菌屬在改變腸道通透性和疾病嚴重程度中的作用在實驗性關節炎中得到證實[15]。Mena-Vázquez等的研究發現,在RA患者腸道柯林斯菌屬增多,其中精氨酸去亞胺酶活性增高,且多在柯林斯菌屬豐度增加的個體中發現,柯林斯菌屬與RA患者的年齡,高ACPA和吸煙獨立相關[19]。

關于RA患者是否存在腸道菌群的多樣性降低,現有的研究之間未發現一致性,部分研究發現RA患者的多樣性較健康對照降低[12,15,17,18,32],有研究表明這種多樣性的改變與病程和自身抗體水平相關[15]。而近期的數項研究則提示相反的結果[5,21,22],即RA組與健康對照之間的多樣性沒有顯著差異,在2021年Mei等的宏基因測序分析中進一步指出,在其觀測的人群中,存在兩個不同的優勢菌屬,一個以普氏菌屬為優勢物種(HC=3;RA=6),另一個以擬桿菌屬為優勢種(HC=19;RA=16)[21]。這可能解釋了與既往研究矛盾的原因,即對觀測人群采樣造成的誤差。

在腸道代謝方面,Yu等的代謝組學結果顯示,糞便代謝產物中甘油磷脂、鞘脂、犬尿酸、黃脲酸和3-羥基鄰氨基苯甲酸在RA患者和健康對照之間發生顯著改變。色氨酸代謝、α-亞麻酸代謝和甘油磷脂代謝等途徑失調可能有參與了RA的發病[22]。2022年He等通過宏基因測序,發現RA患者腸道中具有產丁酸菌群匱乏和存在大量耗丁酸菌群的現象,而且這些丁酸代謝相關物種豐度與ACPA、類風濕因子等臨床指標呈現強關聯性?；谶@些丁酸代謝菌種的豐度建立的診斷模型,不但可以準確區分患者和健康人群,而且預測患者發生關節變形的準確率高達98.6%。研究從多個側面證實,RA患者的血、糞便丁酸濃度低于健康人,而正常的丁酸濃度可以下調多種促炎因子的表達,誘導Treg細胞分化,抑制Th17和濾泡輔助T細胞(TFH)以及破骨細胞活性,在小鼠RA模型中,膳食補充丁酸制劑,可以通過重新平衡TFH和Treg的水平起到抗炎效果,并減少抗體產生。這些發現揭示了丁酸代謝菌群的重要作用,并顯示出丁酸制劑對于治療RA的潛力[33]。

2.1.3RA患者口腔和腸道菌群的關系 2015年,Zhang等[14]應用宏基因測序比較了類風濕性關節炎(RA)和健康對照組的腸道和口腔的菌群,該研究觀察到腸道和口腔微生物組分存在一致性。與對照組相比,類風濕性關節炎受試者的唾液中富含更多普氏菌屬,但普氏菌屬其中的一種亞類在對照組中富集。然而,在牙菌斑樣本中,普氏菌在健康受試者中比例更高。2021年Mei等[21]的宏基因測序研究中,應用整合微生物基因組(Integrated Microbial Genomes,IMG)的數據比對了RA患者的腸道相對高豐度菌屬的物種來源,發現RA患者富集的菌屬其中有63.16%是人類口腔的定植菌,如鏈球菌屬、奈瑟菌屬和嗜血桿菌屬,而在健康對照中富集物種中有47.62%是人類腸道定植菌。

2.2 腸道微生態對RA關節炎患者治療的影響越來越多的實驗和臨床證據表明,腸道微生物態的組成和功能受到RA治療的影響。動物實驗顯示,在膠原蛋白誘導的關節炎小鼠模型中,依那西普可降低大腸桿菌/志賀氏菌的豐度,并增加了乳酸桿菌,梭狀芽胞桿菌等的豐度[34]。此外,抗生素對腸道菌群的部分破壞加重了RA小鼠模型中的關節炎癥狀[35]。鐵線蓮三萜皂苷可以緩解大鼠關節炎模型中腸道微生物生態失調,從而提高關節炎疾病指數[36]。

Picchianti-Diamanti等的一項研究表明,腫瘤壞死因子α(TNF-α)抑制劑依那西普能夠改變腸道微生態,依那西普治療能部分恢復RA患者的益生菌群[16]。Jeong等進一步討論了益生菌在類風濕性關節炎(RA)中的潛在治療效果及其機制,他們的研究表明長雙歧桿菌RAPO可以通過抑制IL-17和其他促炎介質的產生來緩解RA[37]。

Kim等研究了接受質子泵抑制劑(PPI)、H2受體拮抗劑或瑞巴派特的RA人群,與健康對照組相比,RA患者的腸道微生物群多樣性降低,且組成不同。接受抑酸藥物(尤其是PPI)的RA患者的腸道微生物群與接受瑞巴派特的RA患者的腸道菌群不同。PPI使用者的RA患者中,與細菌的毒力因子相關的代謝通路富集,提示PPI使用不當可能對RA患者有害[32]。

Mei等對接受化瘀強腎通痹方聯合甲氨蝶呤,或來氟米特聯合甲氨蝶呤的RA患者與健康對照的腸道菌群進行對比。研究發現,接受不同治療方案的RA患者均可得到緩解,但是在得到緩解的過程中,除相關臨床指標的緩解趨勢不同外,化瘀強腎通痹方組有11個物種和9個代謝途徑隨時間發生顯著變化,而來氟米特組只有4個物種和2個代謝途徑隨時間發生顯著變化。這些結果為腸道微生物群在RA發病機制中的作用提供了有用的信息,也為開發新的RA治療方法提供了潛在的有效方向[21]。

綜上,腸道作為一種非傳統的免疫器官,其腸道的微生態狀況在RA的發病過程中起到重要作用,而對于RA患者的腸道微生態進行適當的干預,可能對RA的治療具有積極意義。目前關于RA患者腸道微生態相關研究以觀察性研究為主,尚未有前瞻性隊列研究發表,另外,相關研究也主要集中于無系統受累的患者及關節炎動物模型,亟待更多的研究進一步探討腸道微生態與RA的關系。