分子診斷技術在結核分枝桿菌檢測中的應用

劉 芳,劉小娟

(四川大學華西第二醫院檢驗科,出生缺陷與相關婦兒疾病教育部重點實驗室,四川 成都 610041)

結核病(tuberculosis,TB)是嚴重危害人民群眾健康的呼吸道傳染病,是我國重點防控的法定重大傳染病之一,它是威脅人類身體健康和生命安全的重要殺手。2018年,世界衛生組織估計全球新發結核病患者約1000萬,死亡157萬[1],全國第五次結核病流行病學調查結果顯示我國活動性、涂陽和菌陽肺結核的患病率分別為459/10萬、66/10萬和119/10萬,地區、人群分布差異明顯,西部傳染性肺結核患病率約為中部的1.7倍,東部的2.4倍,農村患病率為城市的1.6倍[2]。結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis, MTB) 于1882年由Robert Koch首次提出并認定為結核病的病因[3]。早診斷、早隔離、早治療是減少肺結核發病和死亡的關鍵。但目前大部分結核病臨床表現不典型,病原標本采集困難,大部分患者無法通過傳統實驗室檢查獲得病原學確診[4]。加強結核感染的實驗室診斷,及早篩查出潛伏性結核感染者和活動性結核病,已成為當前控制結核菌感染的重中之重。近年來,分子生物學診斷技術的迅速發展讓更多的MTB分子診斷技術應用于臨床,極大提高了MTB的檢出率。本文就分子診斷技術應用于MTB的應用作一綜述。

1 實時熒光PCR技術

1.1 傳統熒光PCR技術傳統PCR技術以只存在于MTB復合群(包括MTB、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌等)種的特異序列IS 6110為檢測靶點,目前可用于鑒別診斷MTB與非結核分枝桿菌(nontuberculosis mycobacteria,NTM)[5]。Wang 等[6]研究顯示,常規實時熒光定量PCR在不同來源標本中的靈敏度均顯著高于涂片及培養,即使在涂片陰性的情況下其靈敏度及特異度仍較高,分子診斷技術用于MTB診斷的早期,此方法曾普遍應用于醫學實驗室,一方面其具有靈敏度高,速度快的特點,另一方面由于IS 6110并非存在于所有MTB中,部分樣本中MTB載量較低,甚至缺失,可能導致檢出率低,假陰性等情況。

1.2Xpert? MTB/RIFXpert是以結核分枝桿菌的RNA聚合酶活性位點編碼區(81bp rpoB 核心序列)為靶標,采用半巢式實時半定量PCR進行MTB及利福平耐藥基因檢測的方法。無需單獨的核酸提取步驟,檢測試劑集成了提取和擴增過程,通過擴增判讀樣本中是否含有MTB,并對檢出的MTB序列中rpoB 基因進行檢測來判斷有無利福平耐藥。因為85%～90%的利福平耐藥菌株同時對異煙肼耐藥,因此Xpert試劑對rpoB基因的檢測結果又可在一定程度上判斷是否為耐多藥結核菌株。WHO推薦Xpert可作為檢測疑似結核、疑似耐多藥結核或HIV感染的首選方法。研究顯示,對于結核性腦膜炎(tuberculous meningitis,TBM),GeneXpert檢測的靈敏度為23%～52%; 對于結核病并發HIV感染者的腦脊液,GeneXpert檢測的靈敏度為62%,特異度為87.5 %～98 %[7～14]; 也可以通過腦脊液樣本進行離心富集,或提高樣本量至6 ml以上,還可再提高檢測的靈敏度[9～11]。對于有TBM癥狀的患者腦脊液,WHO建議優先使用GeneXpert檢測[15]。

2 基因芯片技術

基因芯片技術是將特定設計的DNA探針規律地固化于芯片表面,形成DNA探針陣列,與熒光標記的靶分子進行PCR雜交, 通過熒光掃描儀自動檢測雜交熒光信號,能夠在同一時間內對MTB進行檢測并分型。其具有靈敏度高、通量大、可分型等優勢;但也存在芯片制備復雜、樣品標記繁瑣、檢測成本高、容易出現非特異性擴增等缺點[16]。 值得一提的是,該方法可以檢測耐藥一線抗結核藥物相關耐藥基因,據Pang等[17]研究顯示,基因芯片法對利福平耐藥的靈敏度和特異度分別為87.56%和97.95%,對異煙肼耐藥的靈敏度和特異度分別為80.34%和95. 82%。Eiu等[18]對基因芯片、Xpert和GenoType MTBDR plus三種方法檢測培養陽性痰標本MTB及耐藥情況,檢出率分別為78%、92%、49%,提示基因芯片法是一種既能檢測出結核菌DNA,也可判斷多重耐藥結核菌感染的方法。

3 恒溫擴增技術

恒溫擴增技術是在恒定的溫度下完成擴增的一類分子生物學技術,其特征為基因擴增過程不需要溫度梯度的循環。恒溫擴增技術對儀器的要求不高,檢測成本相對低一些。近年來以該項技術為基本原理發展起來的分子診斷技術主要有環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、交叉引物法檢測技術(crossing priming amplification,CPA)、實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(simultaneous amplification and testing,SAT)等。2016年,WHO發布的《TB-LAMP在肺結核診斷中的應用》[19]中,對來自全球的感染數據進行了總結分析,建議在診斷疑似肺結核患者時使用TB-LAMP技術作為補充方法,尤其是痰涂片鏡檢陰性時有必要使用此技術進行實驗室檢測。Shete 等[20]曾報道與培養結果相比較TB-LAMP檢測結核分枝桿菌的靈敏度和特異度分別為77.7%和98.1%, 其中涂片陰性患者的樣本檢出靈敏度為42.1%,提示在結核病高發地區TB-LAMP具有較好的診斷能力。CPA是一種同時具備內外部質控的MTB核酸檢測技術,該技術最主要的特點在于速度快,無需單獨步驟提取,結果判讀容易使用。該方法學雖最早應用于結核分枝桿菌核酸檢測上,但真正大放異彩卻是在2020～2022年新型冠狀病毒疫情期間作為新冠病毒核酸快速檢測方法應用與臨床。Wang等[21]報道國內一項研究顯示CPA、Xpert檢測結果與培養結果及臨床診斷結果相比靈敏度和特異度相似。CPA在樣本量不大時能明顯縮短檢測時間,具有較高的靈敏度和特異性,適用于發熱門診及急診。但CPA檢測只能單管檢測,當樣本量較大時,批量檢測反而更慢。SAT是以MTB特異的16S核糖體RNA為靶點進行恒溫擴增結合實時熒光檢測的方法,由于RNA只在活菌中存在,相比其它以DNA為檢測靶標的技術, SAT檢測結果與臨床病情發展實際情況更一致,可用于檢測疾病活動性、監測用藥療效和判斷治愈程度[22]。

4 高分辨率熔解曲線分析技術線(high resolution melting,HRM )

高分辨率熔解曲線技術是通過檢測特異性擴增產物與探針形成雙鏈的解鏈溫度,比較突變序列和野生型序列的溫度差異從而獲得靶基因序列信息[23]。該方法可同時檢測結核分枝桿菌復合群和一線二線抗結核藥物(異煙肼、利福平、乙胺丁醇及氟喹諾酮類藥品)的耐藥基因。Sharma等[24]用高分辨率熔解曲線技術在200例肺外結核患者新鮮組織培養分離菌株中檢測到22例MDR-TB患者(11%),3例(1.5%)單耐RFP患者,8例(4%)單耐INH患者。同時HRM也直接從組織中鑒定出4例培養陰性的MDR-TB患者。HRM檢測結果和測序的結果具有100%的一致性。據吳劍等[25]報道,在170例腦脊液標本中,探針熔解曲線技術的陽性檢出率與BACTAC MGIT 960快速培養法一致。

5 線性探針(line probe assay, LPA)

LPA技術應用生物素修飾的特異引物擴增DNA,PCR產物變性后與固定在膜上的特異寡核苷酸探針雜交,通過雜交信號而獲得序列信息,酶免疫顯色法顯示檢測結果。LPA具有速度快、技術簡單等優勢,但其與基因芯片技術一樣受膜上探針的限制,不能檢測出所有的類型。WHO在2016年推薦MTBDRsl用于痰標本檢測[19]。

6 宏基因組測序技術(metagenomic next-generation sequencing,mNGS)

以上技術是分子診斷技術發展過程中最常使用到的一些技術,但這些技術都有一個共同點,那就是必須預設引物,不能完全區別MTB型別及所有耐藥基因位點。最近幾年,伴隨著二代測序技術普遍應用于臨床微生物檢測領域,其在MTB的檢測也發揮了重要作用。mNGS直接提取臨床標本的全部微生物核酸進行無差別和無選擇性的大規模測序。再將序列信息與已知微生物數據庫比對分析,從而判斷樣本中微生物的種類和含量。

6.1 全基因組測序(wholegenome sequencing,WGS)技術WGS方法是利用DNA測序平臺重新構建生物體基因組的完整DNA 序列。WGS對培養困難的病原體(如MTB)具有明顯優勢。Stucki等[26]在一項研究中,對520例結核病患者分離出來 的標本進行了分型,結果顯示常規的基因分型方法可能會高估MTB在發病率較低國家內的傳播,因為不同的MTB菌株SNPs發生相同突變的可能性很小,所以基于鑒定SNPs的WGS基因分型較其他分子分型方法具有更高的分辨率。在這種應用場景中WGS在肺結核和肺外結核的診斷中均具有較高的敏感度[27～30]。有報道對23例結核性腦膜炎患者腦脊液使用mNGS方法檢測出陽性18例,檢出率為78. 26%,同時結合傳統方法還可以將檢出率提高至95. 65%[31]。同時Xing等[32]在其研究指出,實驗室技術檢測腦脊液中MTB的靈敏度依次為WGS(84. 44%)、GeneXpert ( 40% )、PCR (24. 44% )、培養(22. 22% )、涂片(0 % )。

6.2 病原靶向測序(tNGS)技術tNGS又稱為“小宏基因測序”,其結合多重PCR擴增與高通量測序兩種技術,能夠對待測樣本中幾十種至幾百種已知病原微生物及其毒力和/或耐藥基因進行檢測。與WGS相比,tNGS具有病原譜范圍明確、測序成本低等優勢,而在MTB的檢測中,tNGS的特異度較WGS更高,可同時進行DNA及RNA測序,且能對MTB進行具體分型。因此,tNGS在病原體檢測領域正被逐步接受并大范圍應用。

7 數字PCR技術

數字PCR技術是介于高通量測序技術與實時PCR技術之間的新型PCR技術,其在病原體檢測中的應用場景與其余分子診斷技術不沖突,主要用于絕對定量低豐度的MTB。有報道顯示使用dPCR檢測腦脊液診斷TBM,靈敏度為57.4%,特異性為97.0%,明顯高于GeneXpert和實時熒光定量PCR[33]。但其檢測成本相對較高、通量不大,也在一定程度上限制了在臨床病原體檢測中的應用規模。

8 結語與展望

MTB的實驗室檢測近年來越來越多的依賴于分子診斷技術在其中的應用。大量分子診斷技術被研發并應用于MTB的診斷治療中。每一種方法均具有自己的優缺點,很難有一種方法能覆蓋所有的應用場景。盡管分子技術具有靈敏度高的明顯優點,但目前而言,MTB的實驗室檢測率不高的主要原因仍然在于難以獲取含有足夠病原體的優質樣本及分子診斷技術中對MTB核酸提取和DNA富集的較高要求所致。筆者認為未來分子診斷技術的進一步發展及更多的分子標志物的發現,必然可以進一步提高實驗室MTB檢出率。但并不能片面的一味追求超高的靈敏度,而應該綜合考慮患者的病情發展、經濟狀況、生活環境等情況,選擇經濟、高效、準確、精準、個性化的檢測方案。達到快速檢測、早期診斷、精準治療的目的。