評估慢性乙型肝炎病毒感染者治療效果的新型生物標志物研究進展

劉 媛

(西部戰區總醫院檢驗科,四川 成都 610083)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是急性和慢性肝病的常見原因。世界衛生組織估計,2019年有150萬人感染HBV,296億人患有慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)[1]。HBV是肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)最常見的病因,與未感染的患者相比,HBV感染者發生HCC的相對風險增加15～20倍,全球約50%的HCC病例都是由HBV引起的[2]。盡管核酸類似物(nucleotide analogues,NAs)或干擾素可以有效地抑制HBV復制,但無法清除共價閉合環狀DNA(cccDNA)。目前抗HBV治療的目的主要是抑制與進展性炎癥和纖維化相關的并發癥,即肝功能衰竭和失代償性肝硬化[3,4]。除了永久抑制病毒滴度外,乙型肝炎治療的最終目標是在出現或不出現乙型肝炎表面抗體的情況下實現乙型肝炎表面抗原的消失,即功能性治愈[5]。一些國際肝病學會及中國慢性乙肝防治指南建議,某些患者可以停止NAs治療,特別是那些沒有肝硬化和谷丙轉氨酶持續正常和無法檢測到HBV DNA的患者[3,6]。停用NAs的優點包括增加HBsAg消失率,提高患者依從性,減少長期使用藥物的副作用及降低治療費用。但也存在一些風險,比如嚴重的臨床復發可導致肝臟失代償或死亡[7]。選擇可以停止治療的標志物具有挑戰性,需要平衡風險和收益,最好的標志物是那些能夠預測較低的臨床復發和較高的HBsAg消失率的分子。最近的研究報道了一些HBV生物標志物用于預測停藥后的預后情況,其中包括定量乙型肝炎表面抗原(qHBsAg)[8],乙型肝炎核心相關抗原(HBcrAg)[9],HBV RNA[10]以及一些預測模型[11]。本文針對上述HBV治療效果評估生物標志物的研究進展進行綜述。

1 乙型肝炎表面抗原定量檢測(quantitative hepatitis B surface antigen,qHBsAg)

HBsAg是HBV的外殼蛋白,從HBV的生命周期來看,HBsAg起源于cccDNA和整合型HBV DNA,反映了它們的轉錄活性。HBsAg的定性檢測可用于篩查和診斷HBV感染,其定量檢測可提示治療反應、病毒學應答預測和疾病進展等信息。HBsAg消失被認為是HBV功能性治愈的標志[12]。血液中大約99.99%的HBsAg存在于SVPs中[13]。對于完全病毒學應答或HBeAg陰性的CHB患者,大多數血清HBsAg來自整合型HBV DNA,而不是cccDNA[14]。整合型HBV DNA存在于整個肝臟中,并形成大量的HBsAg,獨立于HBV的復制[15]。

1.1 血清HBsAg水平與其他標志物的關聯在抗病毒治療期間,HBsAg水平與血清HBV DNA相關,HBsAg定量檢測可以反映HBeAg陽性患者的HBV DNA水平,但不能替代HBeAg陰性患者的HBV DNA水平[16]。在一項回顧性研究中,HBsAg水平和血清HBV pgRNA中度相關[17]。血清HBsAg水平被證明可以反映肝臟中的cccDNA水平。無論是基線水平還是治療期間的降低水平,HBsAg與cccDNA和肝內HBV DNA水平均有良好相關性[18]。然而,在HBeAg陽性患者中,基線HBsAg和cccDNA水平的相關性仍存在爭議[19]。

1.2 qHBsAg在抗病毒治療結果預測中的作用治療前較低的HBsAg水平以及治療早期HBsAg的大幅下降,與更高的peg-IFN 持續病毒學應答以及HBsAg消失率相關[20]。治療誘導HBsAg消失的可能性可通過qHBsAg基線水平進行預測,例如HBeAg陰性的CHB患者達到HBsAg血清清除的基線血清qHBsAg明顯較低,低于50 IU/ml的基線水平能夠準確預測HBsAg消失[21]。Lim等評估了qHBsAg、HBV RNA和qHBcrAg在預測HBsAg消失方面的作用。發現治療第8周時,qHBsAg<70 IU/ml是預測HBsAg消失的獨立因素指標[22]。

大多數研究認為,在HBsAg消失后,NAs可以停止使用。但只有少數CHB患者可以實現HBsAg消失。探究HBsAg基線水平或治療結束(end of treatment,EOT)HBsAg水平能否預測HBsAg消失前NAs停止至關重要。Liu等發現,在停止NAs治療的乙型肝炎e抗原(HBeAg)陰性CHB患者中,基線和EOT HBsAg水平可作為預測HBV復發的生物標志物[23]。EOT HBsAg水平與臨床復發或病毒學復發有很強的相關性,較低的EOT HBsAg可能是指導NAs停止的關鍵生物標志物。但EOT HBsAg預測NAs停止的最佳臨界值仍存在爭議。Sonneveld等[24]分析了1216例NAs治療HBeAg陰性并停藥的CHB患者,發現停藥時HBsAg<100 IU/ml是預測停藥后HBsAg持續陰轉的指標之一。

1.3 HBsAg的定量檢測研究從血清或血漿樣本中定量HBsAg通常使用高通量自動免疫分析儀進行電化學發光免疫分析法(ECLIA)測試。雅培Architect HBsAg QT檢測儀可在不稀釋樣本的情況下動態測定0.05～250 IU/ml。羅氏Elecsys HBsAg II測定法和索林LIAISON-XL Murex HBsAg定量法測定法的動態范圍分別為0.05～130 IU/ml和0.03～150 IU/ml。最近,也開發了超靈敏的定量HBsAg檢測方法,將檢測限降低為0.2～5 mIU/ml[25]。不同檢測設備及特點見表1。

2 乙型肝炎病毒核心抗原相關抗原(hepatitis B core-related antigen,HBcrAg)

HBcrAg由前核/核心區域編碼的三種蛋白質組成,包括HBeAg、乙型肝炎核心抗原(HBcAg)和22-kDa前核蛋白(p22cr)[27]。HBeAg是肝細胞分泌的一種循環肽,由前核蛋白經蛋白水解而來。HBcAg是病毒粒子的組成部分,在病毒DNA周圍形成核衣殼。p22cr是一種22 kda的前核蛋白,存在于HBV DNA陰性的空Dane樣顆粒中。這三種蛋白質共享149個氨基酸序列。通過血清學檢測方法,HBcAg、p22cr和HBeAg均可作為HBcrAg檢測[28]。

2.1 HBcrAg與其他生物標志物的關聯血清HBcrAg水平在HBV感染的不同階段有所差異,與肝內cccDNA水平以及血清HBV DNA水平密切相關。Testoni等[29]證實HBeAg陽性患者的血清HBcrAg水平明顯高于未接受抗病毒治療的HBeAg陰性患者。除了轉錄活性外,它們還與血清HBV DNA、肝內HBV DNA、pgRNA和cccDNA水平相關。HBcrAg陰性(<3 log U/ml)患者肝內cccDNA數量和cccDNA活性均低于HBcrAg陽性患者。Hasegawa等[30]建立了CHB患者肝內cccDNA水平的預測模型。該方法基于所使用的變量(FBS、HBcrAg、HBeAg和HBsAg)命名為FBS-cres評分,發現HBcrAg和FBS-cres評分均與cccDNA水平顯著相關。HBcrAg與HBV DNA的相關性在HBV感染的不同階段有所不同,而HBcrAg與HBsAg在所有階段均呈中度相關[31]。

2.2 HBcrAg在抗病毒治療終止點預測中的作用肝病學會HBV感染管理指南描述了停止NAs治療的三個實驗室標準[32]:①至少給藥2年;②采用PCR法檢測不到血清HBV DNA水平;③停止治療時血清HBeAg陰性。當這些標準滿足時,復發的風險可以通過EOT HBsAg和HBcrAg水平來確定。Matsumoto 等[33]也發現EOT HBcrAg水平>3.7 log U/ml預測停用NAs后1年內病毒學復發。Huang等[34]發現EOT HBcrAg<4 log10 U/ml和HBsAb>2 log10 IU/L的組合對持久性功能性治愈的預測價值為100%。Sonneveld等[7]研究了EOT HBcrAg和HBsAg水平與治療停止后結局的關系。較低的HBcrAg水平與較高的病毒學應答率及HBsAg消失顯著相關。HBcrAg水平未檢測到的患者(<2 log U/ml)有最高的病毒學應答和HBsAg消失率。在HBcrAg水平較高的患者中,更易觀察到ALT反彈。Tseng等[35]發現恩替卡韋或富馬酸替諾福韋二吡酯治療的CHB患者,基線HBcrAg≤4 log U/ml和EOT HBsAg水平≤20 IU/ml聯合應用可降低HBV復發風險,增加HBsAg消失率,有助于停藥策略的制定。因此,血清HBcrAg作為替代標志物,可能對計劃停用NAs的患者有較好的預測作用。

2.3 HBcrAg的檢測化學發光酶免疫分析法的發展,HBcrAg的檢測取得了快速進展。通過HBcrAg檢測反映HBV感染進展不受血清中HBeAg清除或HBV基因組中存在前核突變的影響。目前HBcrAg定量檢測的下限為100 U/ml,但推薦的臨界值為1000 (3 log U/ml)[36]。Mak 等[37]使用日本FujirebioLumipulse G1200 CLEIA分析儀,HBcrAg檢測下限為2.0 logU/ml(即 100 U/ml),線性范圍為3.0～7.0 log U/ml。與僅測量HBcAg相比,最近也開發了p22cr(空顆粒)和HBeAg自動檢測系統,通過使測試樣品中的抗-HBc和抗-HBe失效而更加敏感和快速[37]。日本肝病學會指南將HBcrAg水平用于識別低復發風險患者,HBsAg和HBcrAg的臨界值分別為<1.9 log U/ml或<3.0 log U/ml[32]。但如何在CHB患者管理中更好地使用這種新的檢測方法仍然存在爭議[38]。

3 HBV RNA

血清HBV RNA有幾種存在形式,包括HBV前基因組 RNA(pregenomic RNA,pgRNA)、pgRNA剪接變異體和3’端截短型pgRNA以及HBx轉錄本[39]。HBV前基因組RNA可在培養的肝細胞、患者肝活檢和患者血清中檢測到。HBV pgRNA是cccDNA的轉錄本,用于基因組復制,是血清HBV RNA的主要成分。pgRNA已被檢測到其全長形式(flRNA),以及3’截斷和隱聚腺苷化形式(trRNA),非多聚腺苷化3’截斷形式[40]和flRNA的剪接變體[41]。此外,Stadelmayer等[42]使用5’RACE RT-PCR檢測了HBeAg陽性CHB患者血漿中HBx轉錄本的變異。

3.1 HBV RNA與其他標志物的關聯許多研究評估了HBV RNA與其他傳統或新型HBV生物標志物之間的相關性,及其作為替代生物標志物的效用。在初治患者中,HBeAg陽性CHB患者的血清HBV RNA水平高于HBeAg陰性患者[43]。此外,治療和未治療患者的血清HBV DNA和血清HBV RNA水平之間存在很強的相關性[44]。在初治患者中,血清HBV RNA也被發現與HBcrAg相關[45],并與HBsAg和HBeAg中度相關[43]。對初治患者進行單因素分析的研究表明,血清HBV RNA水平與年齡、HBeAg狀態、HBV基因型以及HBV DNA、HBsAg和HBcrAg水平顯著相關[17]。

理論上,血清HBV RNA是肝臟cccDNA水平的潛在預測因子,但似乎依賴于HBeAg狀態。Wang等調查了初治患者慢性感染階段之間的相關性,結果表明HBV復制中間產物與血清HBV RNA的比例因CHB階段而異。與HBeAg陰性相比,HBeAg陽性慢性感染期血清HBV RNA和肝臟HBV DNA的比值最高。血清HBV RNA和DNA之間的相關性在慢性感染的四個階段后仍然存在,但與其他標志物的相關性減弱[17]。同樣,Liu等[46]發現HBeAg陰性慢性感染期血清HBV RNA水平明顯低于HBeAg陰性慢性肝炎期,表明HBV RNA可用于區分初治患者的這兩個感染階段。但必須指出的是,在識別HBeAg陰性患者的慢性感染和慢性肝炎階段時,HBV DNA比血清HBV RNA更有效。

血清HBV RNA與HBeAg陽性感染期密切相關,有潛力預測NAs和/或peg-IFN治療期間HBeAg血清轉化。van B?mmel等人的研究表明,與未實現血清轉化的患者相比,接受NAs治療的患者實現了HBeAg血清轉化,從基線到治療開始后6個月,flRNA和trRNA水平下降幅度更大[39]。血清HBV RNA陰性的NAs治療患者更多實現了HBeAg清除,并且時間更短[47]。

3.2 HBV RNA在抗病毒治療終止點預測中的作用由于血清HBV RNA在HBV病毒完全抑制的患者中仍可檢測到,其在預測治療停止后病毒反彈具有潛在價值。可用于識別肝內cccDNA轉錄活性低的患者,這些患者治療停止后復發的可能性更高。研究人員對33例接受標準NAs治療3年且HBV DNA檢測不到的患者進行了調查。治療結束時可檢測到HBV RNA的21例患者均發生了病毒學復發,而12例檢測不到HBV RNA的患者中只有3例發生了病毒學復發[48]。Carey等在三個不同的臨床隊列中探索了HBV RNA的重要性,觀察到即使當HBV DNA無法檢測到時,HBV仍在繼續復制,停止治療時pgRNA的水平可以代表cccDNA的復制和轉錄,并可以預測HBeAg陰性患者在NAs停用后HBV DNA的再激活和HBV感染加重[49]。對于HBeAg陽性患者,Tsuge等發現HBV DNA聯合RNA與ALT反彈略有關聯[50]。在一項來自2個獨立隊列的研究中,Fan等還證明,停止治療時HBV DNA和RNA均為陰性可以指示無肝硬化的HBeAg陽性患者停止NAs治療[51]。此外,Seto等還建議HBV RNA檢測不出且血清HBsAg<10 IU/ml可預測停止治療且反彈風險低,對于HBV RNA≥44.6 U/ml的患者不應考慮停藥[10]。

值得關注的是,在一項接受NAs治療中位持續時間為13.4年的隊列研究中,血清HBV RNA、DNA和肝臟cccDNA水平未檢測到的患者,在治療停止后仍發生了病毒或ALT反彈[52]。推測延長NAs處理可能使cccDNA池減少到血清HBV RNA過低而無法檢測的程度。因此,血清HBV RNA用于預測病毒學復發的一個重要因素可能是檢測血清RNA的敏感性。國內的一項專家共識建議,對于符合現行停藥標準的接受鞏固治療的CHB 患者,若血清 HBV RNA 檢測陽性,應持續進行抗病毒治療以避免停藥帶來的疾病復發風險[53]。

3.3 HBVRNA的檢測血清HBV RNA檢測和定量的主要方法包括基于cDNA末端快速擴增RT-qPCR(rapid amplification of cDNA ends RT-qPCR,RACE RT-qPCR)、標準RT-qPCR和液滴數字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)。RACE RT-PCR檢測3’聚腺苷酸化RNA由K?ck等首次開發,該方法已被廣泛用于檢測血清pgRNA[54]。van B?mmel等創建了在質粒或RNA標準曲線存在的情況下通過實時PCR對血清HBV RNA相對定量,并設計了特異性引物檢測flRNA和trRNA[39]。一些研究小組也采用了RT-qPCR方法檢測血清總HBV RNA,其中反轉錄涉及一個引物結合到HBV RNA的5 ′端[42]。Wang等首次使用RT-ddPCR該方法擴增preC/C和聚合酶編碼區域內的引物[55]。也有研究采用RT-ddPCR報道了更高的檢測限。

總之,雖然已經開發了幾種方法來檢測血清HBV RNA并確定這一生物標志物的臨床相關性,但由于缺乏標準化的方法和分析靶點,很難對研究進行比較。盡管如此,血清HBV RNA已被證明是一種有價值的生物標志物。

4 展望

除上述生物標志物外,也有一些報道發現抗-HBc以及免疫標志物如CD38和Ki67等對HBV治療效果具有指導意義[57],但仍需要進行大樣本、長期隨訪和多中心研究,以確定其效果。另外也有研究綜合各項指標提出預測模型,多項研究指出SCALE-B評分是預測病毒學復發和HBsAg消失的一個有力工具。停藥時較高的SCALE-B評分與較低的病毒復發風險相關,SCALE-B評分<320的患者中更易觀察到HBsAg消失[9,11,58]。

世界衛生組織提出了到2030年消除肝炎危害的目標,我國作為病毒性肝炎高發區,對CHB患者的個性化治療和精細化管理更加重要。精確生物標志物的開發有助于提高我們對HBV感染自然過程的理解和抗病毒治療過程的優化。近些年的新型生物標志物對風險預測更加準確,但也需看到理想的抗病毒治療程序和預測標志物仍然是一個不斷發展的課題,在今后工作中仍需不斷優化和改進。