鮑魚內(nèi)臟多糖提取物免疫功能的初步研究*

陳思遠(yuǎn)，蕭建斌，蘇經(jīng)遷

（1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福建師范大學(xué)南方海洋研究院，福建 福州 350117；2.福建師范大學(xué)南方生物醫(yī)學(xué)研究中心 福建省天然免疫生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350013）

鮑魚是一種具有重要經(jīng)濟(jì)意義的海洋軟體動物，其漁業(yè)和加工產(chǎn)業(yè)在全球20個國家成為支柱產(chǎn)業(yè)[1]。鮑魚的經(jīng)濟(jì)效益在福建省的水產(chǎn)養(yǎng)殖種類產(chǎn)值中排第一位[2]。目前，鮑魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的興起推動了相關(guān)行業(yè)的蓬勃發(fā)展，并創(chuàng)造了巨大的生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益，但大量廢棄的鮑魚內(nèi)臟帶來新一輪的問題[3]。

鮑內(nèi)臟多糖提取物（abalone viscera polysaccharides extract，AVPE）是通過蛋白酶酶解和超濾技術(shù)從鮑魚內(nèi)臟中分離提取出來的一類大分子活性物質(zhì)[4]。研究表明AVPE富含的多糖、礦物質(zhì)和脂質(zhì)等多種營養(yǎng)物質(zhì)具有抗氧化和增強(qiáng)免疫力等生物學(xué)作用[5]，在生物體內(nèi)發(fā)揮多種生物功能和活性作用，如免疫調(diào)控、抑菌、抗氧化、抗腫瘤等[6-8]，但對其在生物體內(nèi)是否能夠激活特異免疫功能，是否產(chǎn)生慢性或急性毒性還未明確。因此，本研究以C57BL/6小鼠為試驗(yàn)對象，通過對AVPE的免疫功能活性和毒性進(jìn)行探究和驗(yàn)證，為鮑魚副產(chǎn)物的多方面利用提供佐證。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

鮑內(nèi)臟多糖提取物（AVPE）由福建省水產(chǎn)研究所提供，其中多糖含量為58%；豬苓多糖購于上海源葉生物科技有限公司；刀豆蛋白（ConA）購買于美國適馬（Sigma）公司；綿羊紅細(xì)胞（SRBC）、HBSS、DMSO溶液購于北京索萊寶（Solarbio）公司；豚鼠血清（Guinea Pig Serum）購于北京博爾西（Bersee）公司；二硝基氟苯（DNFB）購于上海麥克林（Macklin）公司；復(fù)方環(huán)磷酰胺片（Compound Cyclohosphamide Tablets）購于通化茂祥制藥有限公司。其余藥品均為國產(chǎn)分析純。

Countstar BioTech （IC1000），上海睿鈺生物科技有限公司；INFIINITE 200 PRO酶標(biāo)儀，瑞士帝肯（Tecan）公司；MCO-170AICDL-PC二氧化碳培養(yǎng)箱，日本松下（Panasonic）公司；AVANTIJ-26SXP高速冷凍離心機(jī)，美國貝克曼（Beckman）公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

C57BL/6 小鼠，雌雄比例對半，體重21～25g，均由福建師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)；自由攝水、采食。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物分組、造模及給藥

實(shí)驗(yàn)開始對每只小鼠稱重，將小鼠雌雄各3只分成空白對照組（C），陽性藥物組（PC），AVPE低劑量組（LD），AVPE中劑量組（MD），AVPE高劑量組（HD）。LD、MD和HD組分別用AVPE（20、40、80 mg/kg·d）進(jìn)行灌胃，PC組為豬苓多糖（40 mg/kg·d），C組為同等劑量生理鹽水。藥品由生理鹽水配制，每隔24 h灌胃給藥1次，每只劑量為0.1 mL，自由攝水、采食。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 AVPE 對小鼠體重和臟體比的影響

觀察實(shí)驗(yàn)期間動物的一般表現(xiàn)及形態(tài)，并在AVPE各組小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束前記錄體重及其增量。取各組小鼠，禁食15 h前灌胃給藥1次，記錄體質(zhì)量后，頸椎脫臼處死；取其五臟為心、肝、脾、肺、腎，記錄質(zhì)量并計(jì)算臟器系數(shù)（臟體指數(shù)=器官質(zhì)量/體質(zhì)量×100%）。

2.2 ConA 誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖

參考王璐等[9]的方案在最后一次給藥12 h后，取各組小鼠脾臟于HBSS中，研碎，制成細(xì)胞懸液。取培養(yǎng)板放入細(xì)胞懸液，加入ConA液（10 μg/mL），放入37 ℃培養(yǎng)箱中72 h。每孔取0.8 mL培養(yǎng)液和1 mL DMSO到96孔培養(yǎng)板中，OD值由酶標(biāo)儀（570 nm）測定。

式中：A——淋巴細(xì)胞增殖能力；OD1——ConA孔中OD值；OD2——對照孔的OD值。

2.3 DFNB 誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)性超敏反應(yīng)（DTH）

各組小鼠腹部位置進(jìn)行毛發(fā)脫落，根據(jù)姚滿林等[10]的方案，用50μL的1%DNFB試劑擦拭致敏2 d。在第五天用10μL的DNFB溶液擦拭于各組小鼠右耳（兩面），經(jīng)過1 d的刺激，頸椎脫臼處死小鼠，取下左右耳殼直徑8 mm的耳片過磅。遲發(fā)性超敏反應(yīng)（Delayed Type Hypersensitivity，DTH）以左右耳重量之差表示。

2.4 抗體生成細(xì)胞

參考趙慶楓等[11]的方案，每組小鼠灌胃55 d，腹腔注射0.2 mL SRBC，連續(xù)注射5 d。將脾臟細(xì)胞懸液0.1 mL放于0.3 mL豚鼠血清和0.3 mL 10% SRBC混懸液中混合。離心5 min，取上清于96孔板中，用酶標(biāo)儀（540 nm）測定抗體生成細(xì)胞含量的OD值。

2.5 血清溶血素水平

各分組小鼠連續(xù)灌胃55 d，再連續(xù)腹腔注射5 d的0.2 mLSRBC。根據(jù)朱艷等[12]的方案，對眼球取血，離心收集血清。設(shè)置加0.2 mL10% RBC實(shí)驗(yàn)組在200μL稀釋血清中和200μL生理鹽水的對照組；溫浴后，測定SRBC半數(shù)溶血的OD值（540 nm）。用HC50表示血清溶血素的水平，按下式計(jì)算：

2.6 急性毒性試驗(yàn)

根據(jù)景慕嫻等[13]的方案，對小鼠禁食16 h，不禁水。對正常AVPE組與生理鹽水對照組均灌胃給藥，為0.1 mL 2000 mg/kg的AVPE。14 d內(nèi)記錄小鼠表現(xiàn)及死亡數(shù)。

2.7 骨髓微核率

參考王波[14]的方案，對各組小鼠連續(xù)兩天灌胃給藥。其中，PC組給予 40 mg/kg環(huán)磷酰胺，C組給予生理鹽水，供試組為AVPE組。給藥 6 h后，頸部脫臼處死小鼠，用小牛血清對股骨骨髓制片固定并染色。用顯微鏡記錄每只小鼠1200個嗜多染紅細(xì)胞（PCE），計(jì)算出微核率和PCE/RBC值。

2.8 精子畸變率

對照彭曉明等[15]的方法，每組取6只25～30 g性成熟雄性小鼠，環(huán)磷酰胺（40 mg/kg）為PC組，C組給予生理鹽水，供試組為AVPE組。小鼠連續(xù)5 d灌胃，隔30 d后脫頸處死，取小鼠左右兩側(cè)附睪尾制片和染色，統(tǒng)計(jì)精子畸變發(fā)生率。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

兩組間比較用t檢驗(yàn)，由Graphpad prism 9.0和Adobe Illustrator軟件繪圖。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001；****，P＜0.0001）。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 AVPE 對小鼠臟器比重的影響

臟器系數(shù)增大或減小，可表明動物是否染毒。由圖1可以看出，AVPE各劑量組小鼠的心、肝、脾、肺、腎的臟比重均與C組相似，不具有差異顯著性（P＜0.05）。初步表明鮑多糖對小鼠的心、肝、脾、肺、腎臟器體重比值無影響。

圖1 AVPE對小鼠臟器比重的影響

3.2 AVPE 對小鼠體重的影響

由圖2可知，不同劑量的AVPE與C組相比，小鼠體重在28d持續(xù)灌胃中保持穩(wěn)定，對小鼠體重的變化無顯著變化。試驗(yàn)結(jié)果表明AVPE對小鼠體重變化無影響。

圖2 AVPE對小鼠體重的影響

3.3 AVPE 對脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響

淋巴細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中扮演著免疫識別的角色，可通過刀豆蛋白（conA）和植物血球凝集素來誘導(dǎo)[16]。結(jié)果如圖3所示，C組的淋巴細(xì)胞增殖能力OD值為0.094，三組不同劑量AVPE（20、40、80 mg/kg/d）的OD值分別為0.081、0.080、0.087，與C組相比無差異顯著性（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明口服AVPE對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力無顯著影響。

圖3 AVPE對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力的影響

3.4 鮑多糖對DNFB誘導(dǎo)小鼠DTH的影響

小鼠耳腫脹模型是非特異性炎癥模型，可以通過腫脹程度判斷受試反應(yīng)[17]。通過對比圖4的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與C組相比，LD、MD、HD組的耳腫脹程度無顯著差異性（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AVPE對小鼠細(xì)胞免疫功能無顯著影響。

圖4 AVPE對DNFB誘導(dǎo)小鼠DTH的影響

3.5 AVPE 對小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)的影響

特異性抗體細(xì)胞生成的數(shù)量反應(yīng)了體液免疫的水平[18]。結(jié)果如圖5所示，PC組的抗體生成細(xì)胞數(shù)比C組小鼠略有上升，但無顯著差異性（P＞0.05）。不同劑量的AVPE組對抗體生成細(xì)胞數(shù)無顯著影響（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AVPE對小鼠抗體生成細(xì)胞的增殖無顯著影響。

圖5 AVPE對小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)的影響

3.6 AVPE 對小鼠血清溶血素的影響

SRBC 與相應(yīng)抗體結(jié)合，可導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解，從而統(tǒng)計(jì)血紅蛋白的數(shù)量得知抗體產(chǎn)生的水平[19]。結(jié)果如圖6所示，LD、MD、HD組溶血素表達(dá)量分別為647、647、697，與C組（624）相比無顯著性變化（P＞0.05），表明AVPE對小鼠血清溶血素的表達(dá)無顯著影響。

圖6 AVPE對小鼠血清溶血素的影響

3.7 AVPE 的急性毒性試驗(yàn)

為評價AVPE的安全，試驗(yàn)通過對各組小鼠單次灌胃2000 mg/kg的AVPE，觀察試驗(yàn)小鼠出現(xiàn)的中毒數(shù)量、體重變化及死亡情況，評價受試藥物毒性作用的性質(zhì)[20]。結(jié)果如表1所示，在試驗(yàn)期間，各組小鼠飲食和活動均正常，未有死亡狀況。

表1 鮑多糖的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

3.8 AVPE 對小鼠骨髓微核率和PcE／RBc的比值的影響

微核是細(xì)胞受到外界刺激導(dǎo)致染色體斷裂或紡錘絲受損，而形成異常結(jié)構(gòu)[21]。結(jié)果如圖7所示，LD、MD、HD組的微核率分別為0.162%、0.140%、0.114%，PC組的微核率為0.763%，C組的微核率為0.126%。PC組與C組比較有顯著增加（P＜0.0001），AVPE組與C組相比無顯著性差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AVPE對小鼠骨髓微核率無顯著影響。

圖7 AVPE對小鼠骨髓微核率的影響

骨髓細(xì)胞PcE/RBc的比值可以判斷藥物對骨髓細(xì)胞的毒性作用[22]。結(jié)果如圖8所示，LD、MD和HD組的PcE/RBc比值分別為13.086%、12.424%和12.764%，PC組的平均PcE/RBc比值為10.998%，C組的微核率為12.658%。PC組與C組比較有顯著減少（P＜0.001），AVPE組與C組相比無顯著變化（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AVPE對小鼠骨髓細(xì)胞PcE/RBc比值無顯著影響。

圖8 AVPE對小鼠骨髓細(xì)胞PCE/RBC的影響

3.9 鮑多糖對小鼠精子畸變率的影響

精子畸形是精子基因發(fā)生突變的結(jié)果[23]。如圖9所示，與C相比，LD、MD、HD組的精子畸變率無顯著差異（P＞0.05），PC組的精子畸形率有顯著提高（P＜0.0001）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AVPE對雄性小鼠精子畸形率無顯著影響。

圖9 AVPE對小鼠精子畸變率的影響

4 討論

本文通過對各組小鼠給予適當(dāng)劑量AVPE，探究了AVPE對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明AVPE對小鼠細(xì)胞免疫和體液免疫無顯著效果，同時對小鼠的質(zhì)量、臟器指數(shù)無顯著影響。在毒性經(jīng)口方面，給予高劑量AVPE灌胃小鼠，未表現(xiàn)異常癥狀，初步說明在劑量低于2000 mg/kg的AVPE具有較高的食用安全性，不會對受試動物產(chǎn)生突變作用和生殖毒性。

綜上所述，AVPE未表現(xiàn)出明顯的免疫調(diào)節(jié)作用，研究采用各濃度的AVPE不產(chǎn)生慢性或急性毒性。AVPE作為鮑魚副產(chǎn)物如能有效利用研發(fā)出新型產(chǎn)品，不僅可以開拓鮑魚內(nèi)臟市場，還可以解決環(huán)境污染問題。本研究為鮑魚副產(chǎn)物的加工利用提供科學(xué)依據(jù)和多種出路。