外泌體在多發性骨髓瘤中的作用及其應用前景

李 姣,黃曉兵,2△

(1.電子科技大學,四川 成都 610041;2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院血液內科,四川 成都 610072)

多發性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)作為發病率高居第二位的血液系統惡性腫瘤,截止2020年全球發病率約2.1/10萬(約160000例)[1],是一種起病隱匿、至今仍無法治愈的血液系統疾病,其特點是骨髓漿細胞異常增生伴有單克隆免疫球蛋白或輕鏈(M蛋白)過度生成,導致典型的CRAB癥狀,即高鈣血癥、腎功能不全、貧血、骨病,而絕大多數MM患者會進展為嚴重的溶骨性骨病。MM發病的中位年齡為 69 歲,大約63% 的MM患者年齡超過 65 歲,隨著科技的不斷發展,治療MM的新型藥物不斷更新,但是大多數MM患者仍面臨成為難治性骨髓瘤或治療后復發的困境,全世界每年約有10萬人死于多發性骨髓瘤[2]。外泌體作為細胞間信號傳遞的重要媒介,在MM的背景下,保證了MM細胞和骨髓環境細胞之間不斷的相互作用,目前已證明包含在外泌體中的各種成分,通過支持免疫抑制作用、血管生成、骨質溶解和耐藥性來維持MM腫瘤發生發展,促進MM漿細胞的生長。現階段MM的診斷及療效評估主要以骨髓檢查為主,對于高發病率、高死亡率的MM而言,骨髓檢查無法突破采樣異質性的缺陷,在這種情況下,外泌體能檢測和監測髓外病變的優勢得到彰顯,監測不同階段的外泌體可在一定程度上反映疾病過程,因而外泌體成為近來各大領域爭相研究的熱點。這篇綜述主要關注外泌體在MM發生發展中作用的研究進展,以及其作為生物標志物及治療靶點的應用價值。

1 外泌體簡介

細胞外囊泡(extracellular vesicles, EV)是細胞間進行信息傳遞的重要介質,因大小和分泌途徑不同而分為外泌體、凋亡小體和微囊泡,而礙于提取技術的限制,國際細胞外囊泡學會(ISEV)基于細胞外囊泡研究的最小信息,建議使用小型細胞外囊泡和中大型細胞外囊泡代替外泌體和微囊泡,但根據慣例,許多實驗室仍然習慣性繼續使用“外泌體”一詞,本文中提到的外泌體可互換為小型細胞外囊泡[3]。外泌體是多種正常細胞和惡性細胞分泌的大小30～200 nm的囊泡,其密度在1.13～1.19 g/ml,含有多種生物分子,如蛋白質、核酸和脂質,蛋白質在外泌體表面含量豐富,包括共刺激分子(如CD86)、抗原提呈蛋白(如MHC-I和MHC-II)、膜融合蛋白、細胞間粘附分子1、整合素、四酯酶蛋白、多泡體形成蛋白(如Alix和Tsg10)以及跨膜分子[4]。從生物活性的角度來看,最重要的核酸分子包括mRNA、tRNA、微小RNA(miRNA)和其他非編碼RNA(如長鏈非編碼RNA和環狀RNA)。外泌體分泌是一種組成性現象,參與機體主要的生理和病理過程,決定了外泌體表面分子和內容物,所含生物分子因生理及病理條件、原始細胞類型、起源細胞的不同而有所差異,從而使外泌體具有特異性。由于外泌體具有來源細胞特異性,故其可反應來源細胞的信息,監測外泌體的變化可有助于評估疾病狀態及所處疾病階段。

細胞通過胞吐作用產生外泌體,其被靶細胞攝取,通過在膜上呈遞分子或通過內化后釋放其載物,在局部或遠處的細胞間實現蛋白質、核酸和脂質的轉移,進一步實現多種生物信號的傳遞。外泌體是細胞間信息傳遞的關鍵介質,癌細胞較正常細胞外泌體的釋放率和含量明顯增加[5]。若腫瘤細胞數量增多、長勢良好,則腫瘤來源外泌體釋放量將增多,反之亦然,那么監測外泌體量的變化可反應腫瘤細胞生長趨勢和侵襲性,在一定程度上體現病情的變化。另外,腫瘤來源的外泌體能夠支持腫瘤生長并破壞組織細胞間的體內平衡,細胞外囊泡在驅動轉移前腫瘤生態位的形成中起重要作用,細胞外囊泡能夠通過其物質轉移刺激腫瘤進展,腫瘤來源外泌體還會影響腫瘤微環境中的周圍細胞,導致非腫瘤細胞通過釋放外泌體來促進腫瘤的發生和發展[6],例如慢性粒細胞性白血病細胞釋放的外泌體可以刺激骨髓基質細胞產生支持白血病生長的細胞因子[7];急性髓系白血病細胞系和原代急性髓系白血病母細胞分泌的外泌體進入基質細胞并改變其功能以促進白血病生長[8]。因外泌體所涉及的細胞因子、信號途徑、代謝通路等具有廣泛性和多樣性,故目前為止,其在腫瘤發生發展中所起的作用及具體機制仍未完全清楚,故針對外泌體的研究在腫瘤領域備受青睞。

2 外泌體在MM中的作用

包裹在外泌體中的各種成分可以促進 MM 漿細胞的生長:主要是非編碼遺傳物質,例如miRNA,可作為抑癌基因或致癌基因發揮作用,從而改變 BM 環境,改變細胞因子間平衡,可能有利于骨髓瘤細胞的生長。PIWI相互作用RNA(piRNA)是一種非編碼單鏈RNA,對基因組表達具有至關重要的作用,RNA-004800 (piR-004800) 在源自 MM 受試者的 BM 上清液和培養的 MM 細胞的外泌體中均表達增強,piR-004800 的表達通過鞘氨醇-1-磷酸受體(S1PR)作用PI3K/Akt/mTOR通路調控,在MM細胞生長中起重要作用。除此之外,外泌體中包含的其他非編碼遺傳物質長鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs, lncRNAs),如LINC00461,在MM中大量產生,而間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)來源的外泌體通過控制LINC00461表達刺激MM細胞的生長。另一種不同類型的非編碼遺傳物質是廣泛分布在人體組織中的內源性非編碼RNA—環狀RNA(cirRNA), 其過表達可促進MM細胞生長,如骨髓間充質干細胞(bone marrow stromal cell, BMSCs)釋放的外泌體通過過表達circ_0007841,改變MM細胞的細胞周期,并減少了程序性細胞死亡而促進MM細胞的生長[9～12]。

血液腫瘤和骨髓環境之間的細胞間相互作用,是通過可溶性成分和細胞間連接完成的,外泌體作為作用于生物通訊和生物反應的細胞間可溶性成分,在MM疾病情況下,包含在外泌體中的各種成分保證了MM細胞和骨髓環境細胞之間不斷的相互作用,并通過支持免疫抑制作用、血管生成、骨質溶解和耐藥性來維持MM腫瘤發生發展,促進MM漿細胞的生長。

2.1 外泌體促進MM骨質溶解MM起病緩慢、早期無明顯癥狀,以至于在MM診斷時大約60% 的患者已存在骨病, 骨病帶來的疼痛、病理性骨折將嚴重影響患者生活質量和預后,骨病的發生主要為成骨和破骨失衡所致,而外泌體在打破這一平衡中起到舉足輕重的作用。表皮生長因子受體(epidermal growth gactor receptor, EGFR)系統可以調節不同的生長和分化過程,IL8則是MM骨病中骨損傷的重要刺激物,存在于MM外泌體中的雙調蛋白,能與破骨細胞前體和MSCs中的雙調蛋白結合,從而激活破骨作用并阻止干細胞向成骨細胞分化,同時,源自MM富含雙調蛋白的外泌體進入MSCs能增強MM細胞粘附和IL8的傳遞,參與富含雙調蛋白的破骨細胞生成,使MM外泌體通過雙調蛋白影響成骨細胞和破骨細胞在骨代謝中發揮作用[13]。致癌性NOTCH受體是MM細胞外囊泡傳遞物的一部分,并在細胞外囊泡的致癌能力中起關鍵作用,Giannandrea等[14]證明MM細胞外囊泡的刺激以NOTCH2依賴性方式增加破骨細胞的分化,干擾NOTCH2在MM細胞中的表達,會減少NOTCH2在骨髓瘤來源細胞外囊泡中的數量,并影響破骨細胞生成潛力。那么阻斷NOTCH激活則可阻礙破骨細胞分化,這表明靶向NOTCH途徑可能是治療MM一個有效的策略,以此用于阻斷細胞外囊泡在MM中的致癌作用。外泌體在MM細胞激活破骨細胞和抑制成骨細胞來觸發骨溶解中起作用,其可激活pAkt通路來誘導破骨細胞的形成和活性,由MM細胞分泌于外泌體中的IL-32,在骨髓瘤骨髓缺氧環境下表達增加,在體內和體外均有促進破骨細胞活化的作用[15]。

Raimondi等[16]證明MM細胞外囊泡在小鼠巨噬細胞中通過S724磷酸化誘導未折疊蛋白反應信號分子IRE1α活化,使活化T細胞核因子c1(NFATc1)的轉錄被激活,觸發破骨細胞分化。Wei等[17]證明氨基酰-tRNA合成酶相互作用多功能蛋白1(AIMP1)在體外通過激活NFATc1來促進破骨細胞的分化,然而AIMP1的外泌體包裹的小干擾RNA在體外和體內有效地抑制了破骨細胞分化。人骨髓瘤細胞系衍生的外泌體中的長鏈非編碼RNA(lncRNA) RUNX2-AS1,能夠與RUNX2前mRNA在重疊區域形成RNA雙鏈,負調節RUNX2的表達抑制MSCs向成骨細胞分化,導致MSCs的成骨潛力下降[18],外泌體的RUNX2-AS1可作為MM骨病變的潛在治療靶標。MM外泌體還通過激活Ape1/NF-kB通路觸發BMSCs分泌IL-6,從而阻斷BMSCs向成骨細胞分化,抑制成骨作用[19]。Faict S等[20]通過5TGM1小鼠模型試驗證實了MM外泌體通過誘導DKK-1表達,使Runx2、Osterix 和膠原蛋白1A1表達減少,在增加破骨細胞的形成和活性的同時阻斷成骨細胞分化。與冒煙型多發性骨髓瘤(state of smoldering MM, SMM)外泌體相比,MM外泌體中表達上調的miR-129-5p轉移到MSCs,可抑制轉錄因子Sp1及其靶點堿性磷酸酶,從而阻斷成骨細胞分化、抑制成骨[21]。然而新近研究卻發現[22],樹突狀細胞來源外泌體(尤其是其亞型免疫調節型外泌體),能夠抑制受體樹突細胞的成熟和Th17效應物的誘導,促進調節性T細胞的招募,抑制骨吸收性細胞因子,減少破骨性骨質流失。由上可知,MM來源外泌體通過雙調蛋白、pAkt通路、Ape1/NF-kB通路、IL-32、c-Met信號傳導、S724磷酸化等途徑,激活破骨并抑制成骨作用,促進MM骨病發生發展,然而處于免疫應答中心環節的樹突狀細胞,其來源外泌體具有抑制破骨作用,如在后續骨髓瘤骨病的治療研究中靶向MM患者樹突狀細胞,使其分泌更多外泌體而減少破骨作用,這勢必將給更多的骨病患者帶來福音。

2.2 外泌體促進MM血管生成MM負擔增加了骨髓的自然缺氧,骨髓缺氧環境可增加外泌體的生成,從而引發血管生成,血管生成被認為是MM進展的一個不變特征,對MM發病和發展至關重要。源自MM的外泌體含有高水平的miR-135b,當其轉移到內皮細胞中,會抑制內皮細胞靶標缺氧誘導因子 (HIF)-1α,促進血管生成[23]。另外,作為MM外泌體貨物蛋白的血管生成素、bFGF和VEGF等多種血管生成因子,可通過Stat3磷酸化誘導內皮細胞增殖和血管形成。MM來源的細胞外囊泡含有的piRNA-823轉移到內皮細胞,通過增強 VEGF、IL-6 和 ICAM-1 的表達促進腫瘤增殖、侵襲和血管形成,當在異種移植模型中與MM細胞共同接種時,piRNA-823轉染的內皮細胞可增強腫瘤生長[24]。

與未確定意義的單克隆丙種球蛋白病(monoclonal gammopathy of undetermined signifi-cance, MGUS)患者外泌體相比,MM患者血清的外泌體能改變細胞內c-Src分布和促進NF-kB通路的激活,在內皮細胞中誘導更多的增殖[25]。用C6神經酰胺處理MM 細胞獲得高水平的外泌體 miR-29b,可阻斷內皮細胞中的PI3K-Akt通路來阻斷血管形成[26]。用硼替佐米治療的MM也出現了MM細胞外囊泡成分的改變,具有更多的促炎細胞因子和更少的促血管生成細胞因子,可抑制 NF-KB信號傳導,導致增殖、遷移和血管形成的減少[27]。Giannandrea等[14]不僅證明MM來源細胞外囊泡對NOTCH2途徑的刺激與破骨細胞的分化相關,還證實NOTCH2途徑在刺激內皮細胞的血管生成發揮效應。那么在臨床治療中如果能靶向干擾NOTCH2途徑,則可阻礙MM的血管生成潛力,以達到延緩MM進展的目的。另外,通過上述針對外泌體的研究可知,在骨髓瘤的不同疾病狀態外泌體在量及內容物上的區別可為其作為預測指標奠定基礎。

2.3 外泌體與MM其他組織器官損害腎臟是MM最易受累的器官之一,在一項針對MM合并腎損傷受試者的研究中發現,受試者外泌體中miRNA-140-3p、miRNA-185-5p、miRNA-425-5p、let-7c-5p和let-7d-5p含量明顯偏低,且外泌體中miRNA的數量與臨床特征相關標志物(如血肌酐、IL-6、β2-微球蛋白和b-CTX)的濃度相關[28],由此可知,外泌體在骨髓瘤腎損害中也具有相關性,鑒于目前這方面的研究較少,外泌體在骨髓瘤腎損害發生發展中的具體作用形式及機制需待更深入的研究。

MM所致心臟病變主要為繼發于心臟淀粉樣變性或貧血的嚴重心肌病和心力衰竭,部分為MM治療藥物對心臟功能的損傷,多項研究證明,高達50%的MM受試者出現心臟損傷。研究也證明增強的外泌體來源的circRNA可能導致 MM 相關的心肌改變,此外,聚合酶鏈式反應發現存在于MM 受試者血清外泌體中的circ-G042080的表達量與MM相關的心力衰竭具有相關性[29],外泌體circRNA可能是MM 相關心臟損傷診斷的新型生物標志物,并且可能是相關治療靶點。

異基因造血干細胞移植經過半個多世紀的發展,已成為治愈惡性血液病的重要手段。MM患者使用造血干細胞治療后,也同其他血液系統惡性腫瘤移植一樣,面臨感染、復發、移植物抗宿主病這三大影響生存率的主要問題。 Lia等[30]對41例接受異基因造血干細胞移植的MM患者進行的一項研究表明,CD146 (MCAM-1)與急性移植物抗宿主病(Acute Graft Versus Host Disease, aGVHD)風險正相關,而CD31和CD140-α(PECAM-1和PDGFR-α)與aGVHD風險負相關。除此之外,他們近期一項納入32例患者的研究也證明抗原表達譜(如CD146、CD31、CD140a、CD120a、CD26、CD144和CD30),與aGVHD發病時的外泌體miRNA載體之間存在顯著相關性[31],這表明外泌體抗原可作為MM骨髓移植治療后aGVHD的可能標志物,在監測和預防aGVHD中起作用,而外泌體是否在慢性移植物抗宿主病中同樣發揮作用還需待進一步研究。

3 外泌體作為MM生物標記物

目前沒有任何手段可以預測MM的進展,骨髓檢查作為血液系統腫瘤診斷、療效評估及預測復發的診斷標準,對患者而言骨髓穿刺較外周血采集困難大、疼痛重、耗時長、費用貴,且單一部位骨髓檢查不能反映MM的空間異質性,因此找尋更為簡單、便捷、痛苦小、經濟適用的MM診斷及治療后監測手段成為亟待解決的問題。這時,一種針對體液中循環腫瘤生物標志物進行分析的新方法—“液體活檢”映入研究者的眼簾,在各種循環腫瘤生物標志物中,外泌體因其在早期階段高效診斷癌癥的能力而備受關注。鑒于外泌體具有細胞類型特異性、穩定性和可從體液中獲得性,外泌體可能為癌癥診斷提供有前景的生物標記物,并可能代表癌癥治療的新靶點。MM的病因迄今尚未完全明確,而近年來外泌體作為一種新的通信方式備受關注。目前產生的影響MM細胞的最新分子是單克隆抗體(monoclonal antibodies, mAb),包括抗 CD38 mAb、抗CD138 mAb、抗BCMA mAb和抗 SLAMF7 mAb,它們已用于MM患者的靶向治療[32～34]。今后可以將不同的骨髓瘤靶向分子(例如抗CD138或抗BCMA mAb)設計到外泌體中,以將它們特異性地引導至MM細胞,以達到殺傷MM細胞抑制骨髓瘤發展的作用。

MM之前通常是無癥狀階段的MGUS,15% 的MGUS患者將發展為 MM,有或沒有SMM的中間狀態。目前,骨髓惡性漿細胞百分比用于對MM患者進行分層,其中惡性漿細胞定義為 CD138+/CD38+,然而,CD138可以從膜上脫落,因而需要新的生物標志物來指導MM診斷和治療后監測,而外泌體作為細胞間信息傳遞的中間環節,有明確的可能性被用作免疫球蛋白病進展的初步預測標志物[35, 36]。一項研究表明,血清外泌體來源的miRNA-20a-5p、miRNA-103a-3p 和 miRNA-4505的量,在MM患者、SMM和對照受試者中存在很大差異,外周血中CD138+骨髓瘤來源細胞外囊泡的水平也與MM骨病變的數量呈正相關,此外,與MGUS和SMM患者相比,MM患者的骨髓血清中更多的存在CD38+骨髓瘤來源細胞外囊泡[37]。Yu等[38]發現MM患者的外泌體circATP10A具有預測預后潛力,并與血管生成因子受體蛋白水平相關,表明其參與血管生成。起源于MYC基因的circRNA circMYC可以促進腫瘤細胞的生長,與正常對照組相比,MM受試者的血清外泌體circ-MYC的量明顯增加,且circMYC 表達增加的MM受試者的總生存率和無進展生存期低于circMYC 水平降低的 MM 受試者[39]。外泌體 circMYC 濃度高是MM受試者預后不良的獨立標志,外泌體circMYC水平較高的患者復發率較高,死亡率較高。這些已經被證明的或即將被證明的外泌體來源的RNA,可能是預測MM進展的可能新標志物,并且也可能是新治療方法的目標。

4 總結與展望

總體而言,對外泌體的研究可增加我們對MM發病機制的了解,并為MM患者提供一種新的、有效的診治思路。目前大多數外泌體在惡性血液病中的研究都是基于體外實驗,對外泌體分泌途徑的了解不足,MM衍生的外泌體對MM發生的直接作用仍有待在體內充分闡明。骨髓瘤外泌體可通過外周血獲得,為MM治療后療效評估和復發預測使用外泌體提供便捷,在患者樣本中發現腫瘤衍生的外泌體可以在尚未出現癥狀的早期診斷癌癥,并顯著提高治療的成功率。隨著對外泌體的關注,MM 來源外泌體相關研究的數量明顯增加,尤其是評估小RNA,然而,目前對于哪種MM來源外泌體可作為的生物標志物,還沒有在學術界到達共識。想要利用外泌體作為生物標志物、藥物載體和疫苗,并對其進行合理的修飾,以進行治療干預,對外泌體的進一步研究將探索其在轉化醫學中的潛力,為建立有效的臨床診斷和治療策略提供新的途徑,這些將會是今后研究的方向。