外泌體在多發性硬化中的研究進展

張夢潔,張 磊,秦新月,馮金洲

(重慶醫科大學附屬第一醫院 a.神經內科,b.康復醫學科,重慶 400016)

多發性硬化(multiple sclerosis,MS)是一種病因未明的中樞神經系統炎性自身免疫性脫髓鞘疾病,主要累及腦、脊髓和視神經。其主要病理改變包括中樞神經系統白質脫髓鞘、炎性浸潤和軸突破壞等。外泌體是一種細胞外分泌的多囊泡體,內含細胞的生物分子,如蛋白質、脂質、DNA和RNA等多種成分,釋放到細胞外后,通過多種方式影響受體細胞,包括細胞融合、與受體細胞表面受體的相互作用,以及被受體細胞攝取等,發揮各種生物學功能如抗原呈遞、免疫調節和組織修復等。近年來研究證實外泌體參與MS的多個生理病理改變過程。外泌體不僅參與MS的生理病理改變,而且可以用于預估疾病進展、作為MS的診斷手段和治療方法。本文就外泌體對MS的發病機制及其在MS的診斷和治療中的潛在作用進行綜述探討。

1 外泌體的生物學功能

外泌體屬于胞外囊泡的一種,是含有胞漿質膜的、直徑在30～120 nm的微小囊泡。它主要是細胞內的溶酶體內陷后,形成多囊泡體,當受到刺激(如低氧、氧化應激等)時,多囊泡體釋放到細胞外,形成外泌體[1,2]。它在大部分體液中均能檢測到,如血清、腦脊液、尿液、乳汁、唾液、羊水等[3]。外泌體作為一種細胞之間的信息傳遞介質,可以在細胞與細胞之間交換胞膜蛋白和胞漿,激活受體及下游通路等,發揮不同的生物學功能[4,5]。根據外泌體的細胞來源和靶向功能不同,外泌體中會含有不同的物質,包括脂質、蛋白質、DNA、miRNA、mRNA、非編碼RNA以及來自病毒或朊病毒的遺傳物質[6],并介導不同生物學功能,包括免疫反應、細胞分化和細胞凋亡的調節等[7]。同時,外泌體表面也含有多種生物標志物,一些是共有的,如CD9,CD63,CD81、Alix、熱休克蛋白70、MHCⅠ等[3,8～10];另一部分生物標志物則依賴于其來源的細胞類型不同而異,如少突膠質細胞釋放的外泌體可攜帶髓鞘蛋白脂蛋白(myelin proteolipid protein ,PLP)、2′3′-環核苷酸磷酸二酯酶(2′3′-cyclic-nucleotide-phosphodies-terase,CNPase)等[11],它們可能參與膠質細胞介導的軸突營養支持;而樹突狀細胞(dendritic cells ,DCs)釋放的外泌體攜帶功能性肽-MHC復合物,可直接激活特異性抗原效應T細胞或傳遞給其他DCs以激活未激活的特異性抗原T細胞[12]。

2 外泌體在MS發病機制中的作用

研究提示外泌體在MS的病理生理和發病過程中起著關鍵作用。在MS患者的血清和腦脊液中外泌體含量明顯升高[9],外周炎性細胞通過釋放含有γ-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)等炎性細胞因子的外泌體,進而損傷內皮細胞,破壞血腦屏障,介導MS發病[13]。內皮細胞功能受損、血腦屏障通透性升高,進而使外周激活的淋巴細胞更易經損傷的BBB進入中樞神經系統,繼發脫髓鞘、軸突破壞等一系列典型病理損傷。另一方面,這些囊泡中表達的炎性細胞因子打破Th17和Treg T細胞之間的平衡,促進疾病進展[14]。又有研究指出,外泌體參與MS的發病主要是因為外泌體中所含的miRNA。MS患者的血清中提取的外泌體含有一種miRNA是let-7i,其作用于幼稚T細胞,使幼稚T細胞向IFN-γ-IL-17A-Foxp3+CD4+T細胞分化減少[15],進一步降低體內Treg 細胞,破壞Th17/Treg平衡,從而導致疾病發生。在Murugaiyan等的研究中,miR-155被證實為實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠炎癥反應的主要調控因素,靶向敲除miR-155基因導致中樞神經系統和外周淋巴器官中Th1和Th17細胞的分化減少,miR-155的敲除以及藥物靶向治療均導致EAE小鼠的發病過程延緩和疾病嚴重程度減輕[16]。此外外泌體中的miR-21和miR-219激活小膠質細胞和巨噬細胞,釋放促炎因子TNF-α和IL-6等[17,18],促使MS的的發病和殘疾進展,以上均說明外泌體通過不同的miRNA參與MS的發病過程。

然而,Thangavelu等提出,MS患者牙周膜干細胞分泌的外泌體可以通過調控TRL-4受體和NF-κB,進而調控NALP3,產生抗炎因子IL-10和TGF-β等,從而抑制EAE小鼠的炎癥反應[19]。同時,低劑量IFNγ刺激DC細胞產生的外泌體中含有miR-219,可以增加髓鞘的生成和氧化應激的耐受能力[10],說明外泌體在MS的發病過程中有致病和抗炎雙重作用,具體可能與細胞來源有關,其調控機制有待進一步研究。

3 外泌體在MS診斷中的作用

幾乎所有體液中均在健康和疾病條件下檢測到外泌體,包括尿液、血液、血清、腦脊液、母乳和精液等[20]。其含有的各種標記蛋白,奠定了外泌體可作為疾病診斷的生物標志物的分子基礎。外泌體內包含的蛋白質、miRNA及其他核酸物質等,可以通過血腦屏障從血液進入大腦,行使細胞間通訊作用,間接反映腦內的狀態,使其成為潛在的神經免疫性疾病生物標志物。

MS至今尚無高度特異的生物學標記物。近年的研究表明,MS患者的血清和腦脊液中所含外泌體可以作為一種診斷標志物。Welton等指出在MS患者的血清中提取的外泌體中含有50多種蛋白質,且有30種已被報道與MS的疾病進展有關[21]。Azimi等研究觀察到,在復發緩解型多發性硬化(relapsing remitting multiple sclerosis,RRMS)患者中,與健康對照組相比,外泌體中miR-326的表達顯著上調。這提示外泌體中這種miRNA的異常表達可能作為一種診斷和預后的生物標志物[22]。有文獻指出,實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠腦脊液中小膠質細胞衍生的外泌體的濃度能反映病情的嚴重程度以及疾病階段[23]。此外,在不同亞型的MS患者的血清中外泌體中均能檢測到含量更高的MOG蛋白,且其嚴重程度與Gd增強MRI的表現一致[9]。并且內皮細胞分泌的外泌體聯合CD31濃度的檢測對MS的臨床診斷與釓增強磁共振成像相比具有更高的靈敏度[3]。

研究進一步發現,外泌體不僅可早期診斷MS,更可以區別MS亞型。在不同亞型的MS患者分離的外泌體含有不同的miRNA,采用Logistic回歸和ROC曲線、森林圖等分析后發現不同亞型的miRNA表達量差別很大。單個miRNA區別亞型的概率僅66%,而聯合多個指標敏感性可達95%[6]。揭示了外泌體的檢測可以作為一個更簡便更有效的診斷手段。Ebrahimkhani等通過采用下一代測序技術和綜合生物信息學方法,揭示了血清外泌體miRNA譜能夠準確地區分MS患者與健康對照組,同時還能區分RRMS與進展型多發性硬化(progressive multiple sclerosis, PMS)[24],為外泌體成為MS潛在的生物標志物提供了重要線索和依據。

4 外泌體在MS治療中的作用

由于血腦屏障的存在,絕大部分藥物不能直接通過血腦屏障進入中樞神經系統發揮作用。目前研制出的納米顆粒藥物技術也尚未成熟,納米的毒性和快速被清除等問題也有待解決。外泌體是內吞的多泡體分泌而來,具有與人類細胞相同的胞膜和胞漿[2],可以有效通過血腦屏障,同時降低藥物的清除率,可以作為有效的藥物載體之一。

髓鞘再生是髓鞘損傷部位的信號因子募集少突膠質細胞前體細胞(oligodendrocyte precursor cell,OPCs)到該損傷處后生成髓鞘[25],而促進髓鞘再生是延緩MS進展的治療方向之一。研究指出,樹突狀細胞分泌的含有miR-219的外泌體,增加了髓鞘再生和氧化應激的耐受性[10],而Pusic等也證實了含有miR-219的外泌體能增加髓鞘再生[26],參與其免疫調節作用,從而抑制MS的進展。有研究發現[27],利用具有高表達配體 PDGF-A的神經干細胞(neural stem cells,NSCs)釋放的外泌體(extracellular vesicles and particles,EVPs),大大增強了對少突膠質細胞譜系的靶向能力。此外,與單獨施用 EVPs 或 T3(三碘甲腺原氨酸)相比,全身注射 EVPs + T3 顯著降低了EAE小鼠的臨床評分,增強了少突膠質細胞的存活,抑制了髓鞘損傷,并促進了EAE小鼠的髓鞘再生,從而抑制疾病進展,這為MS提供了一種有效的治療策略。

Manna等分析了MS患者在治療前后的血液外泌體相關miRNA。結果顯示,在接受干擾素-β(IFN-β)治療的復發緩解型MS患者中,有14種外泌體相關miRNA明顯下調,而有2種外泌體相關miRNA明顯上調。這表明外泌體相關miRNA具有作為多發性硬化治療反應生物標志物的潛力[28]。Riazifar采用EAE小鼠模型,對人間充質干細胞(MSCs)分泌的外泌體在治療MS方面的效果進行了評估。結果表明,經IFNγ刺激的MSCs產生的外泌體(IFNγ-Exo)通過靜脈注射與PBS對照組相比,能夠顯著降低EAE小鼠的平均臨床評分,減輕脫髓鞘和神經炎癥,并上調了EAE小鼠脊髓內CD4+CD25+FOXP3+調節性T細胞(Tregs)的數量[29]。Xue等設計制備了一種新型的納米制劑,使用巨噬細胞衍生的外泌體作為載體負載天然產物白藜蘆醇(RSV&Exo),研究發現在小鼠MS模型中,通過鼻內給藥RSV&Exo顯著抑制了中樞神經系統和外周的炎癥反應,并有效改善了MS的臨床進展[30]。因此,外泌體劑型能夠作為MS的潛在治療靶點,并有巨大開發研究前景。

5 外泌體在MS臨床應用中的不足

目前外泌體的提取和保存尚存在一定的困難。首先,外泌體的分離目前還是依靠外泌體的直徑、密度和生物標志物。而胞外囊泡含有三種:壞死小體、微粒體和外泌體。而外泌體(直徑在30～150 nm)和微粒體(直徑在20 nm～1 μm)直徑有相交,導致提取的外泌體純度不足[31]。其次,目前外泌體的提純主要采用梯度離心后超速離心法,可能會導致外泌體分離物中含有微粒體和其他細胞碎片。且不同來源細胞的外泌體,其大小、密度、標志蛋白表達量都可能存在差異[32]。同時超速離心法本身對外泌體也有一定的損害[33]。近年來越來越多的分離方法涌現出來,如采用不同孔徑和凝膠的濾過膜,多聚化合物如PEGs,免疫親和法如磁分離法,納米等離子體分析和動態光散射技術等,但目前在應用中均有限制。因此,研發既能獲得高純度又具有高特異性的外泌體,并確保其產量供應的方法,仍然是當前外泌體研究的核心方向之一。最后,盡管外泌體的推薦保存條件為-80 ℃,但在處理或運輸過程中,有時難以保持這種低溫環境。一項研究提出了一種凍干法,采用海藻糖作為保護劑,在冷凍過程中發揮生物保護作用,如穩定蛋白質、細胞膜和脂質體,減少冰的形成,避免蛋白質和外泌體的聚集,以及減少在分離和保存過程中損失細胞外囊泡等[34]。需要注意的是,由于不同來源的外泌體具有異質性,因此不同種類外泌體的最佳保存條件可能會有所不同,需要進一步研究探討。此外,目前關于外泌體的不良反應仍不明確,也限制了其在臨床中的應用[35]。

6 總結與展望

本文介紹了外泌體的生物學功能以及在MS的發病機制、診斷和治療中的作用。外周炎性細胞通過外泌體刺激血腦屏障的內皮細胞,增加血腦屏障的通透性,導致腦內炎性細胞浸潤,軸突破壞等。而MS患者的血清外泌體中含有特殊的miRNA,可對MS做出更有效的診斷。同時,外泌體標本主要來源于血清、尿液、唾液等,用于MS的診斷較長久以來MS患者依靠腦脊液免疫檢測和MRI影像檢查進行診斷的方法更加簡單、無創。而具有脂質雙層結構的外泌體,很好地保護了內含物質的降解,并且保存時間相對較長,加大了檢測時間窗。此外外泌體能夠很好地穿過血腦屏障,可以作為一種生物載體,參與MS的治療。與此同時,外泌體中還含有許多其他物質如DNA、RNA、非編碼RNA等,這些物質的作用是否與MS的疾病發生發展、診斷、治療相關,尚有待進一步探索和證實。